Atualmente existe uma forte tendência mundial para o desenvolvimento de testes in vitro que supram o uso de animais em ensaios de avaliação de segurança. Em 1986 a Diretiva Europeia 86/609/EEC induziu a discussão mundial de redução de testes em animais e a 7ª emenda desta Diretiva, publicada em 2004, determinou a transferência dos ensaios para a avaliação de risco para sistema in vitro. Diferentes abordagens foram desenvolvidas para suprir essa necessidade como, por exemplo, a geração de equivalentes de epiderme, que foi considerada a mais promissora e extensamente investigada. Dois modelos de equivalentes de epiderme (EpiDermTM-MATTEK e EPISKINTM LORÉAL) comercialmente disponíveis foram validados pelo ECVAM (Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos) e outros modelos de epiderme reconstruída estão sendo desenvolvidos em diferentes laboratórios de pesquisa do mundo. Esses dois modelos são recomendados no Guia 431 (Organização para cooperação e desenvolvimento econômico - OECD) que avalia in vitro a corrosão da pele. No Brasil esta prática ainda é inexistente, porém deverá ser implementada rapidamente para que atenda aos conceitos humanitários internacionais. Sendo assim, este projeto teve como objetivo criar, dentro dos princípios do Guia 431, um equivalente de epiderme e posterior otimização deste processo através da incorporação de uma membrana biopolimérica (PET e colágeno I) como suporte celular. O modelo de epiderme humana reconstruída consiste de um tecido epidérmico diferenciado tridimensionalmente a partir de queratinócitos humanos normais cultivados em um meio quimicamente definido na interface ar-líquido. A validação deste modelo para ensaios de avaliação do potencial corrosivo de substâncias foi realizada seguindo os princípios do Guia 431 da OECD, sendo que quatro substâncias da lista indicada pelo Guia foram testadas: duas corrosivas (Ácido Lático e Ácido Octanóico) e duas não corrosivas (2-bromo Etilbenzeno e Benzilacetona), assim como controles positivo (Acido acético) e negativo (NaCl 0,9%). Os resultados de viabilidade celular após 3 minutos e 1 hora de exposição às substâncias teste demostraram que o nosso modelo permite distinguir as substâncias entre corrosivas e não corrosivas, no entanto não permite a subcategorização das corrosivas em 1A ou 1B/C. Assim, nós demonstramos o potencial do nosso modelo como um método de teste relevante e confiável que pode ser usado para pesquisa e investigação de risco químico. Visando a otimização do modelo, testamos a incorporação de uma membrana biopolimérica eletrofiada de PET e colágeno tipo I como suporte para crescimento celular em substituição ao transwell. A análise histológica das membranas demonstrou que as mesmas são biocompativeis, permitindo adequada adesão e proliferação dos queratinócitos e dos fibroblastos, no entanto, não se observou uma diferenciação adequada com a formação de uma epiderme semelhante à humana (estratos basal, espinhoso, granuloso e córneo). Além disso, a falta de uniformidade e reprodutibilidade nos resultados indicam que é necessário uma otimização dos processos de fabricação das membranas e geração do equivalente epidérmico. Em perspectiva, este equivalente epidérmico poderá ser utilizado para pesquisa e avaliação de risco de fármacos, medicamentos, cosméticos, praguicidas, etc., contribuindo para a geração de métodos alternativos aos testes em animais e inserindo o Brasil na tendência internacional do desenvolvimento de testes para avaliação do risco. / Currently there is a strong global trend towards the development of in vitro tests that fulfill the use of animals in safety evaluation tests. In 1986, the European Directive 86/609/EEC led to the discussion of global reduction of animal testing and the 7th amendment of this Policy, published in 2004, ordered the transfer of the tests for risk assessment for in vitro system. Different approaches have been taking into account to achieve this goal, for example, the development of epidermal equivalents models, which have been considered the most promising and widely studied model. ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) has validated two models of reconstructed epidermis (EpiDermTM - Mattek and EPISKINTM - L\'Oréal) that are commercially available and other models are being developed in different research laboratories in the world. These two models are recommended in Guide 431 (Organisation for Economic Cooperation and Development - OECD) for in vitro evaluation of skin corrosion. In Brazil, this practice is still lacking, but should be implemented quickly so that meets international humanitarian concepts. Therefore, this project aimed the creation, within the principles of Guide 431, of an epidermal equivalent and the optimization of this process through the incorporation of a biopolymer membrane (PET and collagen I) as cellular support. The reconstructed human epidermis (RHE) consists of a differentiated three-dimensional epidermal tissue reconstructed from normal human keratinocytes in a chemically defined medium and air liquid interface growth. The validation of this model for the assessment of skin corrosion potential of substances was performed following the principles of the OECD Guide 431, hereupon four substances from the list indicated by the Guide were tested: two corrosive (lactic acid and octanoic acid) and two non-corrosive (2-phenylethyl bromide and benzylacetone) and positive (acetic acid) and negative (NaCl 0.9%) controls. The cell viability results after 3 minutes and 1 hour of exposure to the test substances indicates that our model is capable of distinguishing the substances among corrosive and non-corrosive. Although they do not, allow the sub-categorization of corrosive in 1A or 1B/C. Thus, we have demonstrated that our model is a potentially relevant and a reliable test method that could be used in research and specifically for the investigation of chemical hazard. To optimize the model, we tested the incorporation of a biopolymer membrane composed of PET and type I collagen as support for cell growth, as a replacement of the transwell. Histological examination of membranes has shown that they are biocompatible, enabling adequate adhesion and proliferation of keratinocytes and fibroblasts. However, there was no adequate differentiation with the formation of a similar human epidermis (stratum basale, spinosum, granulosum and corneum). Moreover, the lack of uniformity and reproducibility of the results indicates that it is still necessary to optimize the membranes production process and the generation of the epidermal equivalent using the membranes as support. In perspective, the developed epidermal equivalent may be used for research and risk assessment of pharmaceuticals, medicines, cosmetics, chemicals, pesticides, among others. This directly contributes to the development of alternative methods able to substitute animal testing in Brazil and follows the international trend of development tests for risk assessment.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26062015-103653 |
| Date | 11 May 2015 |
| Creators | Catarino, Carolina Motter |
| Contributors | Maria-Engler, Silvya Stuchi |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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