Human color perception is mediated by cone photoreceptor cells which mainly locate on the fovea of the eye. Bright light activates the photosensitive opsin pigments which are embedded in the outer segment membrane discs of cone retinal cells thereby initiating the complex process of photopic vision with a fast response. The cone visual pigments are G-protein coupled receptors which share analogous structure and functional features with rhodopsin, the most thoroughly studied G-protein coupled receptor from rod photoreceptor cells mediating scotopic vision and distributed throughout the retina. These visual pigments modulate spectral tuning of visible light depending on the molecular variance around the protein bound chromophore, 11-cis-retinal, which is a vitamin A derivative acting as an inverse agonist. Various mutations have been clinically identified in the cone opsin genes and associated with visual dysfunction ranging from mild color blindness to severe cone dystrophies. As the crystal structure of the cone pigments is yet to be resolved, identifying key molecular mechanisms that play major roles in optimal functioning of these photoreceptor proteins, should be helpful in providing a deeper understanding of their function and in designing novel therapeutic strategies for congenital retinal cone dysfunction.
In order to study such light sensitive, delicate membrane proteins, the human cone opsin genes have been transiently expressed in mammalian cells, regenerated with their natural chromophore and immunopurified in dark conditions. The purified recombinant chromophore-regenerated cone opsins in solution have been characterized in detail by means of biophysical approaches, including spectroscopic, biochemical, and functional analysis, in order to uncover novel properties that help in optimizing the function of these receptors. Site-directed mutagenesis was employed to obtain the clinically identified mutations in cone opsins related to visual disorders and to compare the structure and function of these mutated opsins with the molecular properties of the wild-type cone opsins expressed in the same way.
The results of the present study indicate that the cone opsins are less stable in solution and their retinal binding site is more open than rhodopsin. The ligand binding studies using retinal analogs, show that the photoactivated rhodopsin loses its ability to regenerate with its natural chromophore with time but not with an analog, 9-cis-retinal but cone opsin shows regeneration with both retinal analogs under the same experimental conditions.
The highly identical red and green cone opsins exhibit different ligand binding modes during regeneration with their natural chromophore, 11-cis-retinal. A secondary retinal uptake, with a slower kinetics, has been also observed with the red and green cone pigments during regeneration with 11-cis-retinal which is altered in the case of blue cone opsin. The role of specific amino acids involved in the regeneration mechanism has also been clarified.
Most of the cone opsin mutants studied, associated with visual disorders, fail to regenerate with the ligand due to protein misfolding resulting in aggregation in solution. R330Q green cone opsin mutant show a regeneration ability similar to that of the native pigment but a compromised transducin binding efficiency. Though the N94K deuteranopic mutant apparently aggregates when expressed in mammalian, chromophore binding to opsin would be through an unprotonated Schiff base linkage.
Overall, in the present study the molecular properties of cone opsins have been compared among them and with the well-studied rhodopsin. This has led to the proposal of novel molecular mechanisms for cone opsins. The determined structural differences between visual pigments may be linked to their molecular evolution, and the proposal of secondary retinoid binding to visual pigments may function as a regulatory mechanism of dark adaptation. / La percepción del color humano se realiza a través de las células fotorreceptoras de los conos, localizados en la fóvea del ojo. La luz brillante activa los pigmentos fotosensibles que se encuentran en los discos de membrana del segmento externo de estas células iniciando con ello el complejo y rápido proceso de la visión fotópica. Los pigmentos visuales conos son receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que comparten estructura análoga y características funcionales a la rodopsina, el GPCR más estudiado y localizado en las células fotorreceptoras de los bastones y responsable de la visión escotópica . Estos pigmentos visuales modulan la sintonización espectral de la luz visible, dependiendo de las diferencias moleculares alrededor del cromóforo ligado a la proteína, 11-cis-retinal, que es un derivado de la vitamina A y que actúa como un agonista inverso. Varias mutaciones han sido identificadas clínicamente en los genes de las opsinas de los conos asociadas a disfunciones visuales; desde la leve ceguera al color a la grave distrofia de las células fotorreceptoras. Como la estructura cristalina de los pigmentos de los conos está todavía por resolver, identificar mecanismos moleculares que juegan un papel importante en el funcionamiento óptimo de estas proteínas, ayudará a obtener una comprensión más profunda de su función y al diseño de nuevas estrategias terapéuticas para la disfunción congénita de los conos. Con el fin de estudiar estas proteínas de membrana sensibles a la luz y delicadas, se han expresado transitoriamente en células de mamífero, regenerado con su cromóforo natural, inmunopurificado en oscuridad y se han caracterizado por medio de técnicas biofísicas, bioquímicas, y funcionales, a fin de descubrir nuevas propiedades que ayuden a la optimización de su función. Mutagénesis dirigida se ha utilizado para obtener las mutaciones clínicamente identificados en opsinas de conos relacionados con los trastornos visuales y comparar la estructura y la función de estas opsinas mutadas con las propiedades moleculares de opsina de conos cono salvaje. Los resultados del presente estudio indican que las opsinas de los conos son menos estables y su sitio de unión al retinal es más abierta que en la rodopsina. Estudios de unión al ligando utilizando análogos del retinal, muestran que la rodopsina fotoactivada pierde su capacidad de regenerarse con su cromóforo natural con el tiempo, aunque la mantiene con el análogo 9-cis-retinal, comparado con la regeneración de los conos, que pueden hacerlo con ambos análogos de retinal. Las altamente idénticas opsinas de conos rojo y verde muestran modos de unión diferente al ligando durante la regeneración con su cromóforo natural, 11-cis retinal. También se ha observado una captación secundaria de retinal, con una cinética más lenta, con los pigmentos de los conos rojos y verdes durante la regeneración con 11-cis-retinal que se altera en el caso de los conos azules. También se discute el papel de los aminoácidos específicos implicados en el mecanismo de la regeneración. La mayoría de los mutantes estudiados, no logran regenerar con el ligando debido al mal plegamiento proteico. El cono verde R330Q muestra una capacidad de regeneración similar a la del pigmento nativo, pero con una baja eficacia de unión a la proteína G, transducina. Aunque inicialmente el mutante N94K parece agregado cuando se expresa en células de mamífero, el cromóforo que se une a la opsina a través de una base de Schiff no protonada. En general, este estudio compara las propiedades moleculares de las opsinas de conos entre ellos y con la rodopsina, proponiendo nuevos mecanismos moleculares para las opsinas de conos. Las diferencias estructurales entre determinados pigmentos visuales pueden estar relacionados con su evolución molecular, y la propuesta de la unión secundaria de retinal a estos pigmentos visuales puede funcionar como un mecanismo de regulación de la adaptación a la oscuridad.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UPC/oai:www.tdx.cat:10803/322555 |
| Date | 02 October 2015 |
| Creators | Srinivasan, Sundaramoorthy |
| Contributors | Garriga Solé, Pere, Universitat Politècnica de Catalunya. Departament d'Enginyeria Agroalimentària i Biotecnologia |
| Publisher | Universitat Politècnica de Catalunya |
| Source Sets | Universitat Politècnica de Catalunya |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 171 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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