Les bactéries ont besoin d’adapter leur cycle cellulaire et leur taux de croissance aux changements environnementaux et nutritionnels. L’initiation de la réplication est ainsi strictement coordonnée aux autres processus cellulaire afin de transmettre un chromosome conforme. Chez B. subtilis, bactérie modèle des Gram⁺, la protéine YabA joue un rôle majeur en réprimant l’initiation de la réplication, ceci en formant un complexe avec la protéine initiatrice DnaA et la clamp polymérase DnaN. YabA interagit en outre avec d’autres protéines partenaires et serait donc multifonctionnelle. Sa structure 3D révèle une architecture en deux domaines: Un domaine N-terminal adoptant un repliement de type superhélice et un domaine C-terminal globulaire structuré autour d’un atome de Zinc. In vivo, YabA est un tétramère par interaction entre les superhélices, connecté aux domaines C-terminaux monomériques par une séquence déstructurée hyper flexible. YabA serait un hub structural interagissant simultanément avec plusieurs protéines et constituerait une plate-forme d’intégration entre différents signaux intracellulaires et l’initiation de la réplication. La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité de nombreuses protéines en réponse à certains signaux cellulaires. Grâce à des expériences de phosphorylation in vitro et des analyses de spectrométrie de masse, nous avons montré que YabA est phosphorylée par la kinase de type Hanks YabT sur une thréonine, localisée dans la région flexible de liaison interdomaines. YabT est une kinase activée par l’ADN, exprimée en carence en glucose, en sporulation et en phase stationnaire. Nous avons construit des mutants phosphomimétique de YabA (yabA-T71D) et non phosphorylable (yabA-T71A) pour i) confirmer le rôle de T71 dans la phosphorylation et ii) réaliser des études fonctionnelles.Nous avons montré in vivo que la phosphorylation de YabA n’est pas impliquée dans l’initiation de la réplication, mais module des programmes de différenciation. La phosphorylation de YabA module inversement la sporulation et la formation de biofilm, ce qui souligne sa multifonctionnalité et son implication dans la signalisation cellulaire connectant l’initiation de la réplication et la différenciation. Nos résultats suggèrent que la phosphorylation YabT-dépendante de YabA affecte la différenciation en modulant le taux intracellulaire de Spo0A-P. En effet, la phosphorylation de YabA est corrélée à un taux élevé de Spo0A-P, ce qui stimule la sporulation et inhibe la formation de biofilm. Par ailleurs, nos expériences de chromatographie sur couche fine (TLC) et de “In-Gel” suggèrent que YabA possède une activité “ATP/GTPasique” atypique modulée par la phosphorylation de YabA sur T71. Nos analyses fonctionnelles révèlent un rôle potentiel de YabA sur des voies de signalisation dépendant du c-di-GMP, qui contrôle la formation du biofilm chez de nombreuses bactéries. Ces résultats suggèrent que YabA joue un rôle complexe pendant la différenciation en intégrant différentes voies de signalisation. Enfin, des analyses de LC-MS montrent que lorsqu’elle est surexprimée chez Escherichia coli, YabA est phosphorylée sur la tyrosine 90, qui appartient au domaine d’interaction C-terminal. Une étude double-hybride chez la levure montre que la phosphorylation de Y90 module l’interaction de YabA avec ses partenaires DnaA et DnaN. In vivo, la phosphorylation de Y90 module l’initiation de la réplication. La kinase impliquée n’a pas encore été identifiée, mais ces résultats suggèrent l’existence d’un contrôle de l’initiation de la réplication lié à la phosphorylation de YabA chez B. subtilis. En conclusion, l’ensemble de nos études suggèrent l’existence de différents niveaux de régulation de l’activité de YabA par phosphorylation sur thréonine et tyrosine. YabA, outre son rôle dans l’initiation de la réplication, joue un rôle majeur dans la différenciation de B. subtilis. / Upon environmental or nutritional changes, bacteria must adjust their cell cycle with their growth rate. Most particularly, DNA replication initiation events must be controlled and coordinated with cell physiology to ensure faithful chromosome inheritance. In Bacillus subtilis, a model of Gram-positive bacteria, YabA plays a major role in down regulating initiation replication through interaction with the initiator protein DnaA and the clamp polymerase DnaN. However, YabA is a structural hub protein able to interact with other protein partners, indicating it might be multifunctional. Through its unique overall tri-dimentional structure composed of N-terminal four helix-bundle tetramer connected to four monomeric C-terminal domains by a highly flexible linker, YabA is capable to physically interact with more than one protein at a time, thus providing a suitable platform to integrate intracellular signals to replication initiation. Phosphorylation is the most prevalent post translational modification that modulates protein activities in response to cellular signals. Using in vitro phosphorylation and mass spectrometry we demonstrated that YabA is phosphorylated by the Hanks-type serine/threonine kinase YabT at a threonine residue localized within the flexible inter-domain region. YabT is a kinase activated by DNA and up-regulated during glucose starvation, sporulation and stationary phase. We constructed YabA phosphomimetic (yab-AT71D) and non-phosohorylatable (yabA-T71A) mutants to (i) confirm the requirement of T71 for YabT-mediated phosphorylation in vitro and (ii) perform in vivo and in vitro functional studies.We show in vivo that the phosphorylation of YabA is not involved in initiation control, but rather modulates bacillus developmental processes. We found that YabA phosphorylation inversely regulates sporulation and biofilm formation highlighting the multifunctional role of YabA as well as its role in integrating physiological signals to connect chromosomal replication initiation control with cell development. Our results support a role of YabT-mediated phosphorylation of YabA in Bacillus subtilis life-style decision making through the modulation of Spo0A-P intracellular levels. We established that YabA phosphorylation correlates with high cellular levels of Spo0A-P, leading to sporulation stimulation and preventing biofilm formation. Additionally, thin layer chromatography (TLC) analysis and In-Gel assays showed that YabA possess an atypical "ATP / GTPase" activity. This unusual activity seems to be modulated by phosphorylation of the YabA T71 residue. Our functional analysis pointed to a potential role of YabA in the c-di-GMP signaling transduction pathway, known to regulate biofilm formation in many bacteria. This suggesting a complex regulatory role of YabA during development, involving signaling crosstalk. LC-MS analyzes showed that when overexpressed in Escherichia coli, YabA is phosphorylated on the residue Y90 in a YabT independent manner. Y90 belongs to the interaction C-terminal domain, which contacts DnaA and DnaN. We found that Y90 was involved YabA-mediated replication initiation control. We provided evidence that phosphorylation state of YabA at Y90 can potentially modulates a protein-interaction switch with its protein partners DnaA and DnaN in a yeast-two-hybrid-based assay. Although we did not identified a kinase responsible for the phosphorylation of YabA at Y90 in B. subtilis, this finding hint at the possibility of a YabA-mediated control of initiation modulated by phosphorylation in this bacteria. Thus, all of these in vitro and in vivo observations suggest the existence of different modes of regulation of YabA activity by phosphorylation, involving threonine and tyrosine residues. This study established that YabA, apart from its role during replication initiation, plays a key regulatory role in B. subtilis development.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017SACLS506 |
| Date | 19 December 2017 |
| Creators | García García, Tránsito |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Poncet, Sandrine |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
Page generated in 0.0454 seconds