Six members of the Actinobacillus minor/"porcitonsillarum" complex, strains 33PN and 7ATS, Actinobacillus minor strains NM305T and 202 and "Actinobacillus porcitonsillarum" strains 0347 and 9953L55, were investigated with respect to iron acquisition and haemolysin production. Haemolytic activity has been used, traditionally, to distinguish A. minor and "A. porcitonsillarum", the latter organism being haemolytic and the former, non-haemolytic. Analyses of whole genome shotgun sequences revealed, however, that A. minor strain 202, like "A. porcitonsillarum", possesses a haemolysin-encoding apxII operon while strain NM305T does not. PCR approaches allowed the amplification of apxII genes from strain 33PN, but not from strain 7ATS, suggesting that strain 33PN, but not 7ATS, also possesses an apxII operon. All six strains produced haemolysins that could lyse rabbit erythrocytes. The erythrocyte specificities of the haemolysins produced by strains 202 and 33PN suggested very strongly that the haemolytic activities exhibited by these organisms were due to ApxII. Analysis of the predicted amino acid sequence of ApxII of strain 202, using the bioinformatics tool MitoProt II, revealed that the N-terminal region of this protein has the potential to serve as a mitochondrial targeting signal. In keeping with the apparent lack of apxII genes in strains NM305T and 7ATS, the haemolysins produced by these organisms were not erythrocyte-specific and haemolytic activity appeared to be due to a combination of heat-labile and heat-stable components.All six strains acquired iron from porcine, bovine and human haemoglobins but not from porcine transferrin. Analyses of whole genome shotgun sequences revealed that strains NM305T and 202 lack not only the transferrin-binding protein genes, tbpA and tbpB, but also the haemoglobin-binding protein gene, hgbA. Strains NM305T and 202, however, were found to possess other putative haemin/haemoglobin-binding protein genes that were predicted to encode mature proteins of ~72 and ~75 kDa, respectively. An affinity procedure based on haemin-agarose allowed the isolation of ~65- and ~67-kDa iron-repressible outer-membrane polypeptides from membranes derived from strains NM305T and 202, respectively, and mass spectrometry revealed that these polypeptides were the products of the putative haemin/haemoglobin-binding protein genes. PCR approaches allowed the amplification and sequencing of homologues of both haemin/haemoglobin-binding protein genes from each of the other four strains, strains 33PN and 7ATS and "A. porcitonsillarum" strains 9953L55 and 0347, suggesting that such proteins are involved in the utilization of haemoglobin-bound iron, presumably as surface receptors, by all six strains investigated. / Six membres du complexe d'Actinobacillus minor/"porcitonsillarum", souches 33PN et 7ATS, souches NM305T et 202 d'Actinobacillus minor, et souches 0347 et 9953L55 d'Actinobacillus 'porcitonsillarum', ont été étudiés en ce qui concerne l'acquisition du fer et la production d'hémolysine. Traditionnellement, l'activité hémolytique a été employée afin de distinguer entre A. minor et 'A. porcitonsillarum', le dernier organisme étant hémolytique tandis que le premier étant non hémolytique. Cependant, l'analyse génomique des séquences entières de shotgun ont indiqués que la souche A. minor 202, tel que 'A. porcitonsillarum', possède un opéron d'apxII qui code pour l'hémolysine alors que la souche NM305T n'en possède pas. Les approches de PCR ont permis l'amplification des gènes d'apxII de la souche 33PN, mais pas de la souche 7ATS, suggérant que la souche 33PN, mais pas 7ATS, possède également un opéron d'apxII. Tous les six souches ont produit des hémolysines qui pourraient lyser des érythrocytes provenant du lapin. Les spécificités d'érythrocyte des hémolysines produites par les espèces 202 et 33PN ont indiqué que les activités hémolytiques de ces souches étaient dues à ApxII. L'analyse de la séquence d'acides aminés de la souche de Apxll 202, en utilisant les outils de bioinformatique MitoProt II, a révélé que la région N-terminale de cette protéine a le potentiel pour servir de signal d'adressage mitochondrial.En accord avec la possibilité d'un manquement de gènes d'apxII chez les souches NM305T et 7ATS, les hémolysines produites par ces organismes n'étaient pas spécifiques à l'érythrocyte et l'activité hémolytique semblait être due par une combinaison des composants labiles à la chaleur et thermostables.Tous les six souches avaient acquis le fer provenant de l'hémoglobines porcines, bovines et humaines mais pas de la transferrine porcine. Les analyses génomiques des séquences entières de shotgun ont démontré que les souches NM305T et 202 manquaient non seulement des gènes codant pour des protéines pouvant lier la transferrine, en particulier le tbpA et du tbpB, mais également le gène hgbA qui code pour le protéine pouvant lier des hémoglobines. Cependant, les souches NM305T et 202 se sont avérées de posséder d'autres gènes putatif codant pour des protéines pouvant lier le haemin/hémoglobine qui ont été prévus de coder pour des protéines matures de ~72 et ~75 kDa, respectivement. Une procédure d'affinité basée sur l'agarose de haemin a permis l'isolement des polypeptides répressif du fer provenant de la membrane externe des souches de NM305T and 202, respectivement, et ayant une masse entre ~65 et ~67-kDa, tandis que la spectrométrie de masse a démontré que ces polypeptides étaient les produits des gènes putatif codant pour des protéines pouvant lier le haemin/hémoglobine. Les approches de PCR ont permis l'amplification et le séquencement des homologues de gènes codant pour les protéines pouvant lier le haemin/hémoglobine de chacune des quatre autres souches, notamment les souches 33PN et 7ATS, et souches 9953L55 et 0347 d'A. "porcitonsillarum", suggérant que de telles protéines sont impliquées dans l'utilisation du fer lier a l'hémoglobine, vraisemblablement en tant que des récepteurs trouvant sur la surface, par chacune des six souches étudiées.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.97091 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Arya, Gitanjali |
| Contributors | Donald F Niven (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Natural Resource Sciences) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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