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Previous issue date: 2008-03-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / The Gram-positive genus Bacillus is of great biotechnological importance. Their
ability to secrete enzymes efficiently during fermentation is exploited for the production
of extracellular enzymes such as penicillin G acylase (PGA). Bacillus megaterium has
proven to be an excellent alternative host to Escherichia coli for heterologous gene
expression. Unlike other bacilli strains, proteolytic degradation by alkaline proteases is
avoided. In addition, there are no endotoxins found in the cell wall. As a result, protein
yields are exceptionally high even if inexpensive substrates are used.
In this work, the growth conditions of B. megaterium ATCC 14945 and its
preparation for transformation by electroporation with plasmid DNA had been studied.
Vegetative cells and protoplasts of B. megaterium had been used. Plasmid DNAs (pET-
32, pETduet-1, pBR322 and pHis 1522) were prepared from E. coli strains DH5α and
BL21. Bacteria cultures were growth in Luria-Bertani (LB) broth, Nutrient or LBS (LB
containing 0,5 M sorbitol) medium.
It had been used the following Electroporation Media: 25% PEG 6000/0.1 M
Sorbitol (Moro et al., 1995), 0.625 M Sacarose/1.0 mM MgCl2, pH 5.5 (Dunny et al.,
1991), HEPES 10 mM, pH 7.0 (Belliveau & Trevors, 1989) and SMG (0.5 M sorbitol,
0.5 M manitol and 10% glicerol) (Xue et al., 1999). As Recovery Media after electric
pulses, LB and LBSM (LB containing 0,5 M sorbitol and 0.38 M manitol) had been
used.
Extractions of genomic DNA of B. megaterium and plasmid DNA of E. coli had
been carried through. The Colonies Forming Units method (CFU) was applied in order
to analyze the B. megaterium viability before and after treatment with Electroporation
Media. The biomass produced (Cx) was analyzed spectrophotometrically and by the
Dry Mass method. The morphology and pureness of B. megaterium cultures had been
studied by optic microscopy preparations and B. megaterium growth in liquid selective
media. The best electric conditions for electroporation had been established by
preliminary tests. B. megaterium transformations was performed according to protocols
described by Moro et al. (1995), Dunny et al. (1991), Belliveau & Trevors (1989), Xue
et al. (1999) and Romero et al. (2006).
The B. megaterium growth curves in LB, Nutrient and LBS had allowed the
identification of growth phases of cultures and the respective electric conditions
adjustment for electroporation protocols.
The cellular concentration (dry mass) found for 16 hours of culture in Nutrient,
LB and LBS medium had been 1.900 g/L, 2.649 g/L and 2.320 g/L, respectively.
The viable cells concentration analyses (UFC) had allowed the adjustment of
plasmid DNA concentrations employed and transformation efficiencies calculation.
It had been found the following cellular densities of B. megaterium grown in
Nutrient, LB and LBS medium respectively after PEG/Sorbitol Electroporation Medium
treatment: 8.8 x 108; 9,2 x 108 and 2.3 x 109 UFC/mL. For Sacarose/MgCl2, it had been
found 2,8 x 107; 4.6 x 108 and 3.7 x 108 UFC/mL and for HEPES 5.6 x 108; 2.93 x 109
and 1.86 x 108. For SMG, it had been found 1,7 x 109; 9.4 x 109 and 1.1 x 1010 UFC/mL
for Nutrient, LB and LBS medium, respectively. / Bacillus são bactérias Gram-positivas de grande importância biotecnológica. Sua
habilidade para secretar enzimas eficientemente durante a fermentação é utilizada para a
produção de enzimas extracelulares como penicilina G acilase (PGA). Bacillus
megaterium revelou-se excelente hospedeiro alternativo à Escherichia coli para a
expressão de genes heterólogos. Diferentemente de outras linhagens de bacilos, a
degradação proteolítica por alcalino-proteases não é verificada. Além disso, não são
encontradas endotoxinas em sua parede celular. Consequentemente, os rendimentos de
produção de proteínas são excepcionalmente elevados, ainda que substratos econômicos
sejam utilizados.
Neste trabalho, foram estudadas as condições de crescimento de células de B.
megaterium e sua preparação para transformação por eletroporação com DNA
plasmidial. Foram utilizadas células vegetativas e protoplastos de B. megaterium ATCC
14945 e as linhagens de E. coli DH5α e BL21 (para amplificação e manutenção dos
plasmídeos pET-32, pETduet-1, pBR322 e pHis 1522).
Os meios de crescimento empregados foram Nutriente, Luria-Bertani (LB) e
LBS (LB contendo 0,5 M sorbitol). Para as eletroporações, foram utilizados os Meios
25% PEG 6000/0,1 M Sorbitol (Moro et al., 1995), 0,625 M Sacarose/1,0 mM MgCl2,
pH 5,5 (Dunny et al., 1991), HEPES 10 mM, pH 7,0 (Belliveau & Trevors, 1989) e
SMG (0,5 M de sorbitol, 0,5 M de manitol e 10% de glicerol) (Xue et al., 1999). Como
Meios de Recuperação pós-pulso elétrico, foram utilizados os Meios LB e LBSM (LB
contendo 0,5 M de sorbitol e 0,38 M de manitol).
Foram realizadas extrações de DNA genômico de B. megaterium e de DNA
plasmidial de E. coli; ensaios de viabilidade das células de B. megaterium antes e após
tratamento com os diferentes Meios de Eletroporação, pelo Método de Contagem de
Unidades Formadoras de Colônias (UFC); quantificação de biomassa produzida (Cx)
nos cultivos de B. megaterium nos diferentes Meios, pelo Método da Massa Seca, e
acompanhamento por leitura espectrofotométrica (DO 600 nm); análise morfológica e
de pureza dos cultivos por meio de preparações permanentes e a fresco e do crescimento
de B. megaterium selvagem em diferentes meios seletivos; testes preliminares de
eletroporação para estabelecimento das melhores condições elétricas; ensaios de
eletroporação segundo os protocolos de Moro et al. (1995), Dunny et al. (1991),
Belliveau & Trevors (1989), Xue et al. (1999) e Romero et al. (2006).
Foram obtidas as curvas de crescimento de B. megaterium para os Meios de
Cultivo Nutriente, LB e LBS. Tais curvas permitiram a identificação da fase de
crescimento das culturas e o respectivo ajuste das condições elétricas para os protocolos
de eletroporação. As medidas de concentração celular (massa seca) encontradas para 16
horas de cultivo, para culturas crescidas em Meio Nutriente, LB e LBS foram 1,900 g/L,
2,649 g/L e 2,320 g/L, respectivamente.
As análises de concentração de células viáveis (UFC) forneceram a densidade
celular após tratamento com os diferentes Meios de Eletroporação, de modo a permitir o
ajuste das concentrações de DNA plasmidial a serem empregadas e o cálculo das
eficiências de transformação. Após o tratamento de células de B. megaterium, crescidas
em Meio Nutriente, LB e LBS, com o Meio de Eletroporação PEG/Sorbitol, foram
obtidas, respectivamente: 8,8 x 108; 9,2 x 108 e 2,3 x 109 UFC/mL; para o Meio de
Eletroporação Sacarose/MgCl2, 2,8 x 107; 4,6 x 108 e 3,7 x 108 UFC/mL; para o Meio
de Eletroporação HEPES, 5,6 x 108; 2,93 x 109 e 1,86 x 108; para o Meio de
Eletroporação SMG, 1,7 x 109; 9,4 x 109 e 1,1 x 1010 UFC/mL, respectivamente para os
Meios de Crescimento Nutriente, LB e LBS.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6942 |
| Date | 28 March 2008 |
| Creators | Fonseca, Débora Faria |
| Contributors | Giordano, Raquel de Lima Camargo |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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