Die Kultivierung equiner Trachealepithelzellen stellt ein nützliches Modell dar, die (patho)-physiologischen Mechanismen der obstruktiven Atemwegserkrankungen des Pferdes auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Ziel dieser Arbeit war es, Methoden für die Isolation,
Charakterisierung und weitergehende Kultivierung equiner Trachealepithelzellen (ETEZ) zu etablieren und validieren und die Expression und Funktionalität der beta-adrenergen Rezeptoren
an frisch isolierten ETEZ und deren Primärkulturen mittels pharmakologischer und biochemischer Verfahrenstechniken zu analysieren. Epithelzellen wurden durch Trypsinverdau aus der Trachea gesunder Pferde gewonnen, indem zuerst die Mukosa der
Trachea freigelegt und diese dann vom daruntergelegenen Bindegewebe stumpf getrennt wurde. Das gewonnene Gewebe wurde zerkleinert und enzymatisch mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für 2 h bei 37°C verdaut. Durch Siebung und Zentrifugation wurden die Zellen
gereinigt, vereinzelt und gesammelt, wobei kontaminierende Fibroblasten später durch differentielle Adhäsion von den Epithelzellen getrennt wurden. Die isolierten Zellen wurden sowohl licht- bzw. elektronenmikroskopisch charakterisiert, als auch immunzytochemisch
hinsichtlich Zytokeratin (für Epithelzellen) und Vimentin (für Fibroblasten) gefärbt. Die durchschnittliche Zellausbeute wurde mit der Neubauer-Zählkammer bestimmt und betrug 6,10 ± 0,63×106 Zellen pro 500 mg zerkleinertem Gewebe (n = 11). Die Zellvitalität wurde
mittels Trypanblau-Färbung ermittelt und betrug 94,70 ± 1,17% (n = 11).
Immunfluoreszensfärbungen zeigten, dass 93,57 ± 1,67% (n = 11) der frisch isolierten Zellen und ca. 100% (n = 5) der Primärkulturen auf Zytokeratin 5/6/18 positiv reagierten. Auf Anti-Vimentin reagierten dagegen nur 9,83 ± 0,94% (n = 11) der Zellen positiv. Die Zellen wurden in einer Dichte von 6,90 x 104 Zellen/cm2 in serumfreiem AECGM ausgesät und bildeten innerhalb einer Woche einen konfluenten Monolayer. Die konfluenten Zellen wurden mittels Dispase II abgelöst. Die erste (P1) und die zweite (P2) Passage konnte erfolgreich in serumfreien AECGM kultiviert und auf der Stufe P2 30 Tage lang gehalten werden. Weitethin wurden die Expression und Funktionalität der b-adrenergen Rezeptoren in frisch isolierten und kultivierten Epithelzellen untersucht. Mittels Radioligandenbindungsstudien, Westernblot, Immunfluoreszensfärbung und cAMP-Assays konnten erstmalig die Dichte, Affinität, Subtypen, Proteinexpression und zelluläre Lokalisation der beta-adrenergen Rezeptoren sowie die Rezeptorfunktion bestimmt werden. Messungen an frisch isolierten ETEZ ergaben für die mittlere Dissoziationskonstante (KD) von 31,78 ± 6,57 pM (n = 7) und eine maximale b-adrenerge Rezeptordichte (BMax) von 12727 ± 883,6 Bindungsstellen/Zelle (n = 7) ermittelt aus Sättigungsexperimenten mit dem b-adrenergen Rezeptorantagonisten [125I] Iodocyanopindolol (ICYP) in Anwesenheit des nicht selektiven beta-Rezeptorantagonisten
(±)-CGP 12177. Für Primärkulturen ergaben sich Werte für KD von 15,26 ± 3,37 pM (n =6) und für BMax von 3730 ± 212 Bindungsstellen/Zelle (n = 6). Bei Verdrängungsexperimenten wurde die ICYP konzentrationsabhängig durch den beta2-selektiven Rezeptorantagonisten ICI 118.551 und den beta1-selektiven Rezeptorantagonisten CGP 20712A verdrängt, wobei für ICI 118.551 eine 10.000-fach höhere Affinität (Ki = 1,74 ± 0,15 nM in frisch-isolierten Zellen und 1,19 ± 0,41 nM in Primärkultur) gezeigt wurde als für CGP 20712A (Ki = 17 ± 7,90 μM in frisch isolierten Zellen). Die cAMP-Bildung wurde in frisch isolierten ETEZ konzentrationsabhängig durch die beta-adrenergen Rezeptoragonisten Isoproterenol, Epinephrin und Norepinephrin in der Reihenfolge ihrer Potenz mit einer EC50 von 58 nM (n = 6), 13,60 μM (n = 6) bzw. 0,43 mM (n = 6) stimuliert. Diese cAMP-Bildung konnte durch Behandlung der Zellen mit 100 nM der beta2-selektiven ICI 118.551, nicht aber durch 300 nM des beta1-selektiven CGP 20712A blockiert werden. Mit einem beta2-adrenergen Rezeptorantikörper konnte eine 72 kDa Proteinbande und mit demselben Antikörper in der Fluoreszenzfärbung Rezeptorantigene auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Zusammenfassend konnten mit dem etablierten Protokoll große Mengen equiner Trachealepithelzellen isoliert und kultiviert werden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen erstmalig, dass primäre equine Trachealepithelzellen funktionale beta2-adrenerge Rezeptoren exprimieren und das Protokoll zur Etablierung eines zellbasierten Modells geeignet ist, um in vitro verschiedene Funktionen und
eine Pharmaka-induzierte Regulation der beta-adrenergen Signalkaskade hinsichtlich physiologischer und pathophysiologischer Zustände bei Atemwegserkrankungen des Pferdes und hierfür relevante pharmakologische und toxikologische Zielstrukturen untersuchen zu können.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-qucosa-38013 |
| Date | 24 June 2010 |
| Creators | Shibeshi Alemayehu, Workineh |
| Contributors | Universität Leipzig, Veterinärmedizinische Fakultät, Prof. Dr. Fritz Rupert Ungemach, Prof. Dr. Fritz Rupert Ungemach, Prof. Dr. Manfred Kietzmann |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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