Die Bedeutung der β-Arrestine als multifunktionelle Adapterproteine GPCR-vermittelter Signaltransduktion hat in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. In der vorliegenden Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der molekularen Basis und der Ligandenabhängigkeit sowohl der β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion als auch β-Arrestin- (un-)abhängiger Signaltransduktionsmechanismen. Im ersten Teil wurde der Einfluß potentieller Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des β2AR bzw. im C-Terminus und der TM3 des P2Y1R auf die agonisteninduzierte β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, Internalisierung und Desensibilisierung untersucht. Durch Mutationsanalysen konnten Ser 352/Thr 358 im distalen C-Terminus des P2Y1R als Schlüsselstellen der β-Arrestin-Translokation und Internalisierung identifiziert werden, während ein oder mehrere Phosphorylierungsstellen im proximalen P2Y1R C-Terminus die molekulare Grundlage der Rezeptordesensibilisierung darstellen. Darüber hinaus machte die Anwendung verschiedener PKC- oder CaMK-Inhibitoren sowie der Einsatz des PKC-Aktivators PMA deutlich, dass die P2Y1R-Desensibilisierung und β-Arrestin-Translokation durch unterschiedliche Kinasen kontrolliert werden. Zudem konnte mit Hilfe der FRET-Technik gezeigt werden, dass die Phosphorylierungsstellen zwischen den Positionen 355 und 364 im proximalen β2AR C-Terminus essentielle Bereiche der β-Arrestin-Translokation darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Agonisten am β2-adrenergen Rezeptor bzw. dem P2Y2R auf ihre Fähigkeit hin untersucht verschiedene mit dem jeweiligen Rezeptor verknüpfte G-Protein- bzw. β-Arrestin-Funktionen in unterschiedlichem Ausmaß zu aktivieren („biased agonism“). Da eine solche ligandenselektive Aktivierung rezeptorvermittelter Signalwege bis dato nur mit synthetischen Liganden detailliert untersucht wurde, galt das besondere Interesse der Analyse der durch die endogenen Substanzen induzierten Signalmuster. Die Betrachtung der Noradrenalin- bzw. Adrenalin-induzierten β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, β-Arrestin2-Translokation, Rezeptorinternalisierung, G-Protein-Aktivierung sowie cAMP-Produktion am β2AR machte deutlich, dass es sich beim Phänomen des „biased agonism“ um einen endogenen Mechanismus handelt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch zur Tokolyse eingesetzte β2AR-Agonisten spezifische Signalmuster induzieren. Die Beobachtung, dass UTP und ATP sowohl unterschiedliche β-Arrestin1/2-Translokationsals auch ERK-Aktivierungsmuster am P2Y2R induzieren bestärkte das Konzept des „biased agonism“ als endogenes Phänomen. Das ligandenabhängige β-Arrestin-Translokationsverhalten des P2Y2R ließ zudem die agonistenbedingte Zuteilung des Rezeptors zu den „Klasse A“ oder „Klasse B“ Rezeptoren zu. Die detaillierte Untersuchung agonisteninduzierter Rezeptor/Effektor-Interaktionen und Signalmuster dürfte helfen die Anwendung klinisch relevanter Substanzen zu optimieren. / In recent years, the significance of β-arrestins as multifunctional adapter proteins of GPCR mediated signal transduction has steadily been increasing. In this thesis the main focus is to research the molecular basis and the ligand dependence of the β-arrestin recruitment as well as β-arrestin-(in-)dependent signal transduction mechanisms. In the first part, the influence of potential phosphorylation sites in the C-terminus of the β2AR or the C-terminus and the TM3 of the P2Y1R, respectively, on the agonist-induced β-arrestin2/receptor-interaction, receptor internalization and desensitization was examined. Using mutation analysis, Ser 352 and Thr 358 were identified as key points of the β-arrestin2 translocation and receptor internalization in the distal C-terminus of the P2Y1R. In contrast, one or more phosphorylation sites in the proximal P2Y1R C-terminus represent the molecular basis of receptor desensitization. In addition, the use of different PKC- or CaMK inhibitors and the application of the PKC activator PMA made it clear that the P2Y1R desensitization and β-arrestin translocation are controlled by different kinases. Using the FRET technique we were able to show that the phosphorylation sites between position 355 and 364 in the proximal C-terminus of the β2AR represent essential areas of the β-arrestin2 translocation. In the second part of the study at hand, agonists of the β2AR or the P2Y2R were examined with respect to their ability to activate distinct receptor associated G-protein or β-arrestin functions to varying degrees (“biased agonism”). Since this kind of ligandselective activation of receptor-mediated signaling pathways has only been studied in detail with synthetic ligands to this day, special interest in the analysis of the signaling pattern induced by the endogenous substances was taken. The analysis of norepinephrine- or epinephrine-induced β-arrestin/receptor interaction, β-arrestin translocation, receptor internalization, G-protein activation and cAMP production at the β2AR made clear that “biased agonism” is an endogenous phenomenon. Moreover, it has also been shown that β2AR agonists used for tocolysis induced a specific signaling pattern. The observation that UTP and ATP both induce different β-arrestin translocation as well as ERK activation patterns at the P2Y2R confirmed the concept of “biased agonism” as an endogenous phenomenon. The ligand dependent β-arrestin behavior of the P2Y2R also allowed the allocation of the receptor to the “class A” or “class B” receptors depending on the agonist used for stimulation. The detailed testing of agonist induced receptor/effector interactions and signaling pattern could help to optimize the application of clinically relevant substances.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:4503 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Nuber, Susanne (geb. Reiner) |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0024 seconds