One of the major goals of current stem cell research is understanding the
mechanism of somatic cell reprogramming by Oct4, Sox2, Klf4 and Myc
(OSKM) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). However, the finding that
only a small proportion of the cells become reprogrammed, typically requiring
>12 days, has hampered progress towards this goal.
C/EBPα is a transcription factor specifically expressed in myelomonocytic
cells within the hematopoietic system whose forced expression in B cells
efficiently induces transdifferentiation into macrophages. We have now found
that an 18-hour pulse of C/EBPα expression followed by OSKM activation
induces an approximately 100-fold increase in the iPSC reprogramming
efficiency, involving up to 95% of the cells within a week. Concomitantly, the
cells undergo an epithelial-mesenchymal transition and pluripotency genes
become upregulated to levels comparable to embryonic stem and iPS cells.
In serum-free conditions the process is further accelerated, with 60% of the
poised and OSKM induced B cells becoming Oct4-GFP positive within 2 days.
These results are consistent with the idea that the C/EBPα pulse helps to
overcome the stochastic phase of iPSC reprogramming. In addition, our work
shed new light on the role of C/EBPα in induced pluripotency. Our data
indicate that C/EBPα acts as a pathbreaker, at least in part mediated by the
dioxygenase Tet2. C/EBPα binds to the Tet2 gene, induces its expression
and translocates the protein to the nucleus. Here Tet2 binds to regulatory
regions of pluripotency genes and converts methylated cytosine residues into
hydroxymethylated cytosines. The pulse also renders the chromatin at
regulatory sites of pluripotency genes accessible to DNase I digestion and,
following OSKM induction, leads to local demethylation and to the binding of
Oct4, correlating with the observed rapid upregulation of pluripotency genes.
In line with an important role of Tet2 as a mediator of reprogramming, coexpression
of the gene with OSKM enhanced B cell reprogramming
substantially. The rapid and highly efficient iPSC reprogramming approach
described herein should help to fully elucidate the early events of
reprogramming to pluripotency and, if applicable to human cells, could have
potential clinical applications. / Actualmente uno de los principales objetivos de la investigación con células
madre es la comprensión de los mecanismos por los cuales las células
somáticas se pueden reprogramar a células madre pluripotentes inducidas
(iPSCs) por la acción de los factores de transcripción Oct4, Sox2, Klf4 y Myc
(OSKM). Sin embargo, la baja eficiencia de este proceso, que tiene lugar
sólo en un pequeño porcentaje de células y que típicamente requiere más de
12 días para llevarse a cabo, ha impedido la consecución de grandes
avances en este campo en los últimos años. C/EBPα es un factor de
transcripción específico de células del linaje mielo-monocítico del sistema
hematopoyético. La expresión ectópica de esta proteína en células B puede
inducir su transdiferenciación a macrófagos. En nuestro estudio de
investigación hemos descubierto que la exposición de C/EBPα durante 18
horas seguida de la activación de OSKM, aumenta en 100 veces la eficiencia
de reprogramación de las iPSC, resultando en la reprogramación del 95% de
las células después de una semana. En detalle, durante este proceso de
reprogramación las células experimentan una transición epitelio-mesénquima
y los genes de pluripotencia se expresan en niveles comparables a los
expresados en células madre embrionarias y iPSC. Cuando la
reprogramación se lleva a cabo en medio de cultivo sin suero el proceso es
aún más rápido, de tal modo que el 60% de las células B inducidas por
C/EBPα y OSKM son positivas para Oct4-GFP en tan sólo dos días. Estos
resultados apoyan la idea de que una exposición transitoria de C/EBPα
ayuda a superar la fase estocástica de la reprogramación de las iPSC.
Además, nuestros descubrimientos aclaran el papel de C/EBPα en el
proceso de pluripotencia inducida, indicando que actúa como un catalizador,
mediado en parte por la actividad de la dioxigenasa Tet2. De tal modo, que
C/EBPα se une a regiones reguladoras del locus de Tet2, induciendo de esta
manera su expresión y translocando la proteína al núcleo. Una vez en el
núcleo, Tet2 se une a las regiones regulatorias de los genes de pluripotencia
y convierte los residuos de citosinas metilados existentes en estas regiones
en citosinas hidroximetiladas. Además, la exposición transitoria de C/EBPα
deja la cromatina más accesible a la digestión con DNasa I alrededor de las
regiones regulatorias de los genes de pluripotencia y, tras la inducción con
OSKM, desencadena una demetilación local favoreciendo la posterior unión
de Oct4 a estas regiones. Todo ello finalmente promueve la expresión
concomitante de los genes de pluripotencia. Adicionalmente, en nuestro
estudio se demuestra que la coexpresión de Tet2 y OSKM aumenta
significativamente la reprogramación de las células B, lo cual se encuentra
en línea con un papel importante de Tet2 en la reprogramación. En resumen,
en este estudio se presenta el sistema de reprogramación de iPSC más
rápido y eficiente descrito a día de hoy. El cual, facilitará la comprensión de
los eventos precoces en el proceso de reprogramación a pluripotencia y, en
el caso de que se pueda extrapolar a células humanas, podrá tener
aplicaciones clínicas relevantes en el campo de la medicina regenerativa.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UPF/oai:www.tdx.cat:10803/283484 |
| Date | 05 June 2014 |
| Creators | Di Stefano, Bruno, 1984- |
| Contributors | Graf, T. (Thomas), Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut |
| Publisher | Universitat Pompeu Fabra |
| Source Sets | Universitat Pompeu Fabra |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 116 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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