In the present work we focus into the potential relevance of PUFAs in some models and human
samples from patients suffering amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Due to its pathological
implication, oxidative stress was our first goal. We started from simple oxidative methodology
screening to search for an antioxidant substance (among 21 different candidates) available in a
Mediterranean diet. The results demonstrated high heterogeneity in carbonyl (measured by
DNP) accumulation, regarding the oxidative source, substrate suffering it and the antioxidant
structure. Further, thanks to GC/MS and LCQTOF, we detailed the protection over specific
accrual of protein and lipid peroxidation markers as well as lipid profile modifications (as % of
total fatty acids -FA) in oxLDL thanks to those dietary compounds. Moreover, we demonstrated
its in vitro relevance, in terms of survival, when two cell lines (HMEC-1, HepG2) were treated
with this oxidized (and protected) compounds, and finally address in vivo importance of those
findings, demonstrating decreased carbonyl and oxidative accumulation in hamsters under an
atherogenic diet supplemented with antioxidants. Once described the protective effect of
antioxidants and specific signatures found regarding lipid oxidation markers, we extend the
study focusing in different ALS samples. From previous work, we demonstrated an altered
docosohexaenoic acid (DHA) composition in different location for patients suffering sporadic
ALS. Hence, we though necessary to define whether the enzymatic machinery aimed to
synthesize DHA from its precursors, are affected in sALS. Interestingly, we found a tissue
specific variation (spinal cord vs cortex), compatible with our previous FA results. Further,
thanks to inmunohistochemistry, differential involvement was unveiled for motor neurons (MN)
and surrounding glia. Therefore, trying to depict cellular contribution, we switch to a neuronal
model (N2A under oxidative stressors and/or aggregation-prone-TDP-43) and a tissular one
(OT). There, we showed decreased desaturase (Δ6) and drebrin expression as well as increased
DHA synthesis and an unreported inverse correlation of drebrin loss and aberrant p-TDP-43
expression under oxidative conditions in the cell culture. In the OT model, lipidomic analysis
showed specific accretion of 8-iso-PGF2α and NPD1 as well as increased DHA (and
dramatically decreased precursors) and reduced AA concentrations (GC measured). Analysis of
slice O2 consumption showed decreased O2 levels under excitotoxic treatment and alleviation by
antioxidant (tocopherol) addition. Treatment of OT slices with Ω-3 precursors (better than final
products) and DHA plus tocopherol ameliorated MNs number. Finally, we wanted to disclose
PUFA’s implication and phenothype of an animal model (SODG93A) under a dietary
intervention with opposed FA unsaturation levels. Not surprisingly, FA profile was difficult to
be altered in nervous system, although subtle specific variations were found. More importantly,
differences in survival and clinical manifestations, UPR (Ubiquitin inclusions), mt-DNA (8-
oxo-dG) and protein oxidative modifications revealed sex as a relevant factor in lipid handling
for this model. Hence, whereas male under a low PUFA diet showed increased survival, females
lack this beneficial outcome. Last but not least, we wanted to dig deeper regarding this sexual
dimorphism. For this purpose, we focused in mitochondria and analyzed spinal cord oxygen
consumption, oxidative damage to proteins and lipid profile along disease progression and also
in a neuronal model (N2A overexpressing SODG93A, treated with 17β-estradiol).We could
demonstrate a clear sexual implication, with females having late onset clinical symptoms
concomitant to an upgraded mitochondrial function and lower protein and mitochondrial
damaged proteins compared with males. Finally, to further confirmed steroid potential as a
protective element in disease progression, in vitro estradiol pretreatmet of N2A showed
increased oxygen consumption, with no relation with the mitochondrial complex expression. / En el trabajo que aquí se presenta se ha profundizado en la relevancia que los ácidos grasos
poliinsaturados (PUFA) puedan tener en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica
(ALS). Dada su implicación en el desarrollo de la patología, el estudio del estrés oxidativo
asociado fue uno de nuestros primeros objetivos. Para ello hemos empezado por un cribado
metodológico simplista, tratando de encontrar una sustancia antioxidante (entre 21),
biodisponible en una dieta Mediterránea equilibrada y que fuese capaz de reducir un daño
oxidativo generado desde diversos frentes (medido como acumulación de carbonilos) y sobre
diferentes substratos. Los resultados demostraron una alta heterogeneidad, dificultando así la
elección de un único antioxidante. Aún así, gracias a la GCMS y la LCQTOF pudimos detallar
la acumulación específica diferenciada de marcadores de daño oxidativo proteico y daño
lipoxidativo producido cuando partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) son oxidadas
bajo la acción de diversos compuestos. Además se pudo objetivar el cambio en la composición
lipídica de estas LDL (medida como % del total presente) y su relevancia biológica in vitro,
medida en términos de supervivencia, cuando se exponen a dos líneas celulares (HMEC-1,
HepG2). Por último se demostró la importancia in vivo, puesto que se pudo observar una menor
acumulación de productos carbonílicos en hámsters alimentados con una dieta aterogénica, pero
suplementada con antioxidantes. Una vez se demostró el papel jugado por estos antioxidantes en
la acumulación diferenciada de productos de oxidación, extendimos el estudio a muestras y
modelos de ALS. En trabajos previos habíamos evidenciado una composición tisular
diferenciada en diversas localizaciones del sistema nervioso en pacientes diagnosticados de
ALS. Por ello consideramos interesante el estudio de la expresión de la maquinaria enzimática
necesaria para la síntesis lipídica. De un modo destacado, pudimos ver de nuevo una variación
tisular, compatible con niveles reducidos de docosohexaenoico (DHA), y gracias a la
inmunohistoquímica también se observaron diferencias entre las motoneuronas (MNs) y la glia
circundante. Así pues, para poder revelar las aportaciones diferenciales de los distintos tipos
celulares, utilizamos una línea celular (N2A) a la que sometíamos a diferentes estresores (daño
oxidativo y sobreexpresión de una versión de TPD-43 que causa agregados) y a un cultivo
tisular de médula espinal (OT), dónde se produce una muerta progresiva y selectiva de las MNs.
Tras estos experimentos, observamos un descenso tanto en la expresión de la Δ6 desaturasa
como de drebrin (marcador presináptico) tras la sobreexpresión de TDP-43, así como una mayor
síntesis de DHA y una correlación inversa entre la pérdida de drebrina y la expresión de pTDP-
43 bajo condiciones de estrés oxidativo. Por otro lado, en el modelo OT, el análisis lipidómico
reveló la acumulación especifica de 8-iso-PGF2α y NDPD1 (posiblemente en respuesta a un
incremento del daño oxidativo) así como el aumento en la concentración de DHA (con un
descenso muy marcado de sus precursores) y el descenso de araquidónico. Quisimos analizar
también el consumo de oxígeno, tanto en tejido intacto como permeabilizado, pudiendo
observar como la excitoxicidad reducía considerablemente su capacidad y como ésta era, en
parte, rescatada con el uso de tocoferol. Además, el tratamiento del OT con precursores Ω-3
mejoró también el número de MNs. Por último, quisimos caracterizar la implicación que los
PUFA dietarios podrían tener en un modelo animal bien conocido (SODG93A). No fue
sorprendente encontrar que el perfil lipídico en el sistema nervioso fue muy difícil de alterar.
Aún así, se observaron diferencias en supervivencia, en el devenir clínico, la respuesta UPR
(con acumulaciones de Ub), el daño al DNA mitocondrial (8-oxo-dG) y modificaciones
oxidativas en las proteínas y cómo éstas tenían un grado de afectación diferencial cuando
considerábamos el sexo de los animales. Esto es, mientras que los machos sometidos a una dieta
baja en PUFAs de cadena larga demostraron una mayor supervivencia, en las hembras no se apreció mejoría. Por último, pero no menos importante, quisimos profundizar más respecto a
este dimorfismo. Centrándonos en la mitocondria, pudimos hacer un seguimiento del consumo
de oxígeno a lo largo de la enfermedad, el daño oxidativo a proteínas y el perfil lipídico. Por lo
tanto pudimos demostrar una clara implicación sexual, siendo las hembras las que más tarde
comienzan su manifestación clínica, con mejores funciones mitocondriales asociadas a un
menor daño oxidativo. Finalmente, la relevancia del papel protector de los estrógenos se pudo
comprobar in vitro, mediante el pretratamiento con 17β-estradiol en la línea N2A que
sobreexpresa SOD1G93A, relacionado con la ALS familiar, proponiéndose el estradiol como un
nuevo elemento que juega un papel relevante en el desarrollo de la enfermedad. / En aquest treball s’ha intentat profunditzar en la possible rellevància dels àcids grassos
poliinsaturats (PUFA) en el tractament de l’esclerosi lateral amiotròfica (ELA). Atesa la seva
implicació en el desenvolupament de la patologia, l’estudi de l’estrès oxidatiu associat fou un
dels primers objectius. Per això, es va començar amb un cribratge metodològic simplista,
intentant trobar una substància antioxidant biodisponible en una dieta mediterrània equilibrada i
que fos capaç de reduir el dany oxidatiu generat des de diferents fronts i sobre diferents
substrats. Els resultats van demostrar una alta heterogeneïtat, dificultant així l’elecció d’un únic
antioxidant. Malgrat això, mercès a tècniques de GC-MS i LC-QTOF, es va poder detallar
l’acumulació específica diferenciada de marcadors de dany oxidatiu proteic i dany lipoxidatiu
produït quan partícules de lipoproteïna de baixa densitat (LDL) s’oxiden per l’acció de diversos
compostos. A més, es va poder objectivar el canvi en la composició lipídica d’aquestes LDL i la
seva rellevància in vitro, mesurada en termes de supervivència, quan es cocultiven amb les
línies cel·lulars. Per últim, es va demostrar la importància in vivo, atès que es va observar una
menor acumulació de productes carbonílics en hàmsters alimentats amb una dieta aterogènica
suplementada amb antioxidants. Un cop es va demostrar el paper d’aquests antioxidants en
l’acumulació diferenciada de productes d’oxidació, es va estendre l’estudi a mostres i models
d’ELA. En treballs previs s’havia evidenciat una composició tissular diferenciada en diverses
localitzacions del sistema nerviós central en pacients d’ELA (respecte l’àcid docosahexaenoic
(DHA), depleció en medul·la espinal i acumulació en còrtex). Per aquesta raó es va considerar
interessant l’estudi de l’expressió de la maquinària enzimàtica necessària per la síntesi lipídica.
D’una manera destacada, es va poder veure de nou una variació tissular, compatible amb nivells
reduïts de DHA i, per tècniques d’immunohistoquímica, es van observar diferències entre les
motoneurones i la glia circumdant. Per tant, per poder revelar les aportacions diferencials dels
diferents tipus cel·lulars, es va utilitzar la línia cel·lular N2A, sotmesa a diferents estressos
(dany oxidatiu i sobreexpressió d’una forma de TDP-43 que causa agregats) i un cultiu tissular
de medul·la espinal, en el que es produeix una mort progressiva i selectiva de les motoneurones.
Es va observar un descens en l’expressió de FADS2 i de drebrina, un marcador sinàptic, així
com una major síntesi de DHA i una correlació inversa entre la pèrdua de drebrina i l’expressió
de TDP-43 sota condicions d’estrès oxidatiu. Per altra banda, en el model organotípic, l’anàlisi
lipidòmica va revelar l’acumulació específica de 8-isoPGF2α i NDPD1, així com l’augment de la
concentració de DHA i el descens motl marcat del seus precursors a mes del àcid araquidònic.
Es va mesurar també el metabolisme oxidatiu, observant-se que l’excitotoxicitat reduïa
considerablement la seva capacitat i, en part, es rescatava amb l’ús de tocoferol. A més, el
tractament dels cultius organotípics amb precursors d’àcids grassos n-3 va millorar el nombre de
motoneurones. Per últim, es va caracteritzar la implicació dels PUFA dietaris en un model
animal d’ELA. Malgrat que el perfil lipídic del sistema nerviós central era difícil d’alterar, es
van observar diferències en supervivència, fenotip clínic, resposta al malplegament de proteïnes
(UPR) amb acumulació d’ubiquitina, dany en el DNA mitocondrial i modificacions oxidatives
en les proteïnes, amb un grau d’afectació diferencial quan es considerava el sexe dels animals.
En aquest sentit, mentre que els mascles sotmesos a una dieta baixa en PUFA de cadena llarga
van mostra una major supervivència, en les femelles nomes va apreciar cap efecte millora. Per
profunditzar en el dimorfisme sexual en ELA, i especialment la disfunció mitocondrial, es va
analitzar mitjançant respirometria d’alta resolució la medul·la espinal durant tot el
desenvolupament de la malaltia. Es va revelar una clara diferència de gènere, amb una
manifestació clínica més tardana en femelles que correlaciona amb una millor conservació de la
funció mitocondrial i un menor dany oxidatiu. El possible paper protector dels estrògens es va demostrar in vitro mitjançant el pretractament amb estradiol de cèl·lules N2A que
sobreexpressen una forma de SOD1 humana mutada associada a l’ELA familiar (G93A-SOD1).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UDL/oai:www.tdx.cat:10803/285530 |
| Date | 24 October 2014 |
| Creators | Cacabelos Barral, Daniel |
| Contributors | Portero Otín, Manuel, Pamplona Gras, Reinald, Universitat de Lleida. Departament de Medicina Experimental |
| Publisher | Universitat de Lleida |
| Source Sets | Universitat de Lleida |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 309 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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