En este trabajo se recogen los resultados obtenidos en el estudio de la producción
extracelular de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura metilotrófica
Pichia pastoris bajo el PAOX1, utilizando una estrategia de alimentación con sustratos mixtos
en la etapa de inducción para cultivos semicontinuos, con el fin de evaluar la viabilidad del
uso del glicerol crudo como cosustrato en la producción de la lipasa para su posterior uso en
la producción enzimática de biodiesel.
En primer lugar se consideró la valorización del glicerol crudo obtenido a partir de
aceites vegetales naturales y reciclados en la producción de biodiesel como una fuente de
carbono para el crecimiento celular y la producción de la ROL. Se concluyó que en los
procesos fermentativos con P. pastoris la utilización de glicerol crudo permite el crecimiento
de la levadura y además no se evidencia un efecto negativo al utilizar glicerol crudo
proveniente de la producción de biodiesel, en términos de rendimiento y velocidad específica
de crecimiento.
El sistema de expresión de la ROL en P. pastoris utilizando el PAOX1 depende de la
utilización del metanol como sustrato inductor. En este trabajo se probaron diversas
estrategias de adición de sustratos mixtos en cultivos semicontinuos para evaluar la
producción de la proteína recombinante bajo este sistema de expresión.
En primera instancia se llevó a cabo una alimentación mixta adicionando pulsos de
metanol y alimentación exponencial con un cosustrato (glicerol). En el ensayo inicial, se
alimentó con metanol como única fuente utilizando pulsos de metanol. Los resultados
muestran que la estrategia de adición de metanol como único sustrato cada 12 horas
mediante pulsos, resulta negativo tanto para el crecimiento como para la producción del
producto heterólogo. En ensayos posteriores se realizaron cultivos en semicontinuo con una
estrategia de alimentación mixta utilizando dos velocidades específicas de crecimiento con
adición exponencial preprogramada de glicerol (0.1 y 0.02 h-1) y pulsos de metanol a dos
concentraciones (10 y 5 g/L) adicionados a diferentes periodos de tiempo (1, 2, 6, y 12 h). Al
utilizar una μ de glicerol de 0.1 h-1 el consumo de metanol se ve afectado, evidenciándose
una clara represión del PAOX1. La concentración de los pulsos de metanol y su frecuencia
tienen una influencia significativa en la producción del producto heterólogo. Posteriormente, se realizó una alimentación manteniendo fija la concentración de
metanol (1.5 y 2 g/L) y el cosustrato siguiendo una alimentación preprogramada para una
velocidad específica de crecimiento constante (0.02 h-1 y 0.05 h-1), Los resultados obtenidos
mostraron que la producción de ROL en P. pastoris no es comparable entre las cepas Mut+ y
Muts, aunque se empleen estrategias de cultivo similares. La presencia del glicerol como
cosustrato no mejora la producción, ni la velocidad específica de producción.
En las últimas estrategias, se planteó la utilización de sustratos mixtos en una
alimentación exponencial preprogramada de glicerol a 0.02 y 0.04 h-1 con metanol para una
velocidad específica de crecimiento de 0.02 h-1, y se realizó una comparación utilizando
como cosustrato sorbitol a una velocidad de crecimiento de 0.02 h-1 con metanol para la
misma velocidad específica de crecimiento.
Se observa que el comportamiento de la cepa con sustratos mixtos glicerol y sorbitol
a nivel de rendimiento Yp/x y productividad volumétrica presenta un comportamiento parecido
al reportado cuando se utiliza metanol como única fuente de carbono. Los resultados de la
velocidad específica de consumo de metanol son iguales cuando se utiliza metanol como
única fuente de carbono y cuando se utiliza sorbitol como cosustrato, lo que muestra que el
sorbitol no ejerce acciones represoras sobre el promotor PAOX1, contrario a lo observado
cuando se utiliza glicerol como cosustrato donde el consumo de metanol disminuye 2.6
veces; mostrándose que, a pesar de encontrarse en condiciones limitantes el glicerol
reprime al promotor PAOX1.
Al utilizar glicerol y metanol como cosustratos se observa un aumento significativo de
la actividad proteolítica independientemente de la velocidad específica de crecimiento sobre
glicerol, lo que no se observó al utilizar sorbitol como cosustrato. Los niveles de biomasa
alcanzados en los cultivos con glicerol como cosustrato son mayores que los alcanzados
con sorbitol, por lo que puede ser que haya un mayor efecto de lisis celular en los cultivos
con glicerol de forma que se recuperan más contaminantes en el producto final, sobre todo
en etapas avanzadas del cultivo, ocasionando una disminución en la actividad específica de
la proteína recombinante. / In this work the results obtained in the study of the production of extracellular lipase of
Rhizopus oryzae (ROL) expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under the
PAOX1, using a strategy of feeding mixed substrates in the induction stage in semi-continuous
cultures are shown.
Firstly, the valorization of crude glycerol obtained from natural and recycled vegetable
oils in the biodiesel production as a carbon source for cell growth and production of ROL was
evaluated. It was concluded that in fermentation processes with P. pastoris using crude
glycerol allows the growth of yeast and no negative effect is observed in terms of yield and
specific growth rate.
The ROL expression system in P. pastoris using the PAOX1 depends on the use of
methanol as the inductor substrate. In this work various strategies are tested to evaluate the
use of mixed substrates for the production of recombinant protein under this expression
system. Preliminarly, it is carried out by adding pulses of methanol and following an
exponential feeding of the co-substrate (glycerol). The results show that the strategy of
adding methanol pulses as the sole substrate every 12 hours is negative for both, cell growth
and production of heterologous product. In subsequent fermentations, semi-continuous
cultures using two specific growth rates with preprogrammed exponential addition of glycerol
(0.1 and 0.02 h-1) and methanol pulses at two concentrations (10 and 5 g/L) added at
different time periods (1, 2, 6, and 12 h) were performed 0.1 h-1 glycerolmethanol
consumption is affected, showing a clear repression of PAOX1. The concentration of
the methanol pulses and its frequency has a significant influence on the production of the
heterologous product.
Subsequently, a different strategy was performed by maintaining the methanol
concentration (1.5 and 2 g/L) and the co-substrate following a preprogrammed feeding with
constant specific growth rate (0.02 h-1 and 0.05 h-1) The results have shown that the
production of ROL in P. pastoris is not comparable between the Mut+ and Muts similar strains
though cultivation strategies are employed. The presence of glycerol as co-substrate
production does not improve the production, and the specific production rate. Finally, the use of mixed substrates was carried out using combined preset
exponential feeding of glycerol (0.02 h-1 and 0.04 h-1) with methanol addition for a specific
growth rate of 0.02 h-1. A comparison was made with the use of sorbitol as co-substrate at
specific growth rate of 0.02 h-1 with methanol addition to let the same specific growth rate.
It is noted the the values of Yp/x and volumetric productivity when glycerol and sorbitol
are used as mixed substrates are very similar than reported when methanol is used as sole
carbon source. The results of the specific rate of methanol consumption are equivalent when
methanol is used as sole carbon source and when sorbitol is used as co-substrate, which
shows that the sorbitol do not exerts repressive action on the PAOX1 promoter, contrary to
what was observed when using glycerol as co-substrate where methanol consumption
decreases 2.6 times; stating that, despite being in limiting conditions glycerol PAOX1 represses
the promoter.
Additionally, by using methanol and glycerol as co-substrates a significant increase in
the proteolytic activity regardless of the specific growth rate of glycerol is observed. However,
this fact was not observed when using sorbitol as co-substrate. Biomass levels achieved in
cultures with glycerol as co-substrate are greater than those obtained with sorbitol, which
might led to a greater cell lyses process and so, more contaminants in the final product,
specially in later culture steps, causing a decrease in the specific activity of the recombinant
protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/313455 |
| Date | 01 July 2015 |
| Creators | Loango Chamorro, Nelsy |
| Contributors | Valero Barranco, Francisco, Montesinos Seguí, José Luis, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 180 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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