Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Nous avons analysé l'activité immortalisante de l'anugène grand T du virus du
polyome marin. Landgène grand T du virus du polyome est en mesure d'interagir
avec pRb in vitro et son activité immortalisante semble dépendre de sa capacité à lier
pRb par le biais d'une séquence contenue entre les acides aminés 141-146. Cette
région contient la séquence consensus de liaison à pRb (D/N-L-X-C-X-E) et est
homologue à la région conservée 2 de la protéine E1A d'adénovirus qui est non
seulement capable d'interagir avec pRb mais aussi avec la protéine pl 07 et pl 30.
Dans un premier temps, nous avons ciblé la région conservée 2 de l'antigène
grand T du virus du polyome. Nous avons démontré que la région conservée 2 de
l'antigène grand T du virus du polyome est nécessaire pour la liaison de pRb, pl 07
et pl 30 in vitro. Nous avons ensuite examiné la nature des interactions entre pRb,
pl 07 et la région conservée 2 de l'amigène grand T du virus du polyome marin et
corrélé la formation de complexes avec l'aaivité immortalisante de la protéine. Pour
ce faire, nous avons généré une série d'antigènes grand T mutants dans la région
conservée 2 en introduisant des mutations ponctuelles au coeur de la séquence
consensus de liaison à pRb et dans sa région C-terminale. Ces antigènes grand T
mutants nous ont permis de démontrer que chaque acide aminé conservé du coeur
de la séquence consensus de liaison à pRb (D/N-L-X-C-X-E) est absolument
nécessaire pour la liaison de pRb et de pl 07 in vitro. De plus, la substitution de
résidus non-conservés dans la région flanquant le coeur de la séquence de liaison à
pRb peut aussi influencer la liaison de pRb et de pl 07 à l'antigène grand T de
polyome in vitro. Les antigènes grand T mutants incapables de former des
complexes avec pRb à des niveaux significatifs in vitro, sont également incapables
d'immortaliser des cultures primaires de fibroblastes embryonnaires de rat in vivo.
Nos résultats suggèrent que la liaison de pl 07 nest pas nécessaire pour conférer à
l'antigène grand T de polyome l'habileté à immortaliser des cellules primaires de rat.
Nous avons donc pu démontrer qu'il y a une corrélation étroite entre la capacité de
l'antigène grand T de polyome à lier pRb in vitro et à immortaliser des cellules
embryonnaires de rat in vivo. Cependant le niveau absolu de liaison de pRb et de
pl 07 in vitro par l antigène grand T n'a aucune influence sur l'activité
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0 immortalisante de la protéine in vivo mais semble plutôt afFeaer les caractéristiques
de croissance des lignées cellulaires dérivées de ces transfections en leur permettant
d'atteindre de plus fortes densités de saturation.
Nous avons aussi démontré l'importance du motif de phosphorylation par
la CKII, flanquant la séquence consensus de liaison à pRb, dans l'activité
immortalisante de l'antigène grand T du virus du polyome. Ainsi, l'addition de
résidus acides dans ce motif vient doubler la fréquence d'immonalisation de la
molécule hybride. De plus, nous avons démontré que la région conservée 2 de
l'antigène grand T de SV40 peut remplacer la région conservée 2 de l'antigène grand
T du virus du polyome marin. La molécule hybride est en mesure d'immortaliser
des cellules embryonnaires de rat à une fréquence équivalente à l'antigène grand T
de polyome sauvage. La deletion des acides aminés correspondant à la position du
domaine de liaison à pRb chez l'antigène grand T de SV40 génère un antigène grand
T mutant qui est en mesure d'immortaliser des cellules embryonnaires de rat à une
fréquence deux fois plus élevée que l'anrigène grand T sauvage. Les lignées cellulaires
dérivées des transfections avec ces trois antigènes grand T mutants possèdent des
phénotypes particuliers. Ces lignées cellulaires sont toutes en mesure de former des
colonies en agar mou à une fréquence élevée.
L'ensemble de nos résultats révèle une corrélation intéressante entre la
capacité de lier les protéines pRb et pl 07 in vitro et l'activiré immortalisante de
l'antigène grand T de polyome in vivo. En efFet, les antigènes grand T mutants
capables de lier pRb à des niveaux équivalents ou supérieurs à la protéine sauvage et
dont la capacité de lier pl 07 est diminuée, démontrent tous une fréquence
d'immortalisation supérieure à l'anugène grand T sauvage. Ces observations nous
amènent à suggérer un modèle d'immortalisation cellulaire par l'anrigène grand T
de polyome où le rapport entre la quantité de pRb et de pl 07 lie par l'antigène
grand T du virus du polyome pourrait avoir un effet sur l'activité immortalisante de
la protéine.
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0 Dans la troisième partie de cette étude, nous avons examiné la contribution
du motif de doigt de zinc à l'activité immortalisante de l'antigène grand T de
polyome. Un fragment N-terminal de 219 acides aminés est en mesure
d'immonaliser des cellules embryonnaires de rat mais à une fréquence équivalente à
seulement 22% de l'antigène grand T sauvage. La formation de complexes de hauts
poids moléculaires, qui nécessite le motif de doigt de zinc, pourrait être importante
pour la pleine activité immortalisante de la protéine. Nous avons delete le motif de
doigt de zinc de l'antigène grand T de polyome et déterminé l'activité
immortalisante de la protéine in vivo. Nos résultats indiquent que la deletion du
motif de doigt de zinc ne diminue pas la capacité de l'andgène grand T mutant à
immortaliser des cellules embryonnaires de rat mais augmente plutôt sa fréquence
relative d'immortalisation. Le motif de doigt de zinc n'est donc pas nécessaire pour
l'immortalisation de cultures primaires de cellules embryonnaires de rat. Ces
résidtats suggèrent que d'autres domaines de la protéine sont néoessaires pour
conférer à l'antigène grand T de polyome sa pleine activité immortalisante.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/33131 |
| Date | 10 1900 |
| Creators | Pilon, André |
| Contributors | Mes-Masson, Anne-Marie |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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