L'importance des techniques de diffraction aux rayons-X pour la détermination de structures macromoléculaires en rapport à la fonction biologique peut être facilement comprise lorsque l'on regarde le nombre de dépôts dans la « Protein Data Bank » (http://www.rcsb.org/pdb). Bien que plus de 100.000 structures aux rayons-X soit actuellement dans la base de données, l'étude des macromolécules biologiques avec des techniques de diffraction aux neutrons a été bien plus limitée. Toutefois, les études qui ont été effectuées, illustrent clairement que la cristallographie moléculaire des neutrons peut fournir d'importante informations complémentaires à celles acquises lors d'études aux rayons-X. En effet, des développements majeurs ont eu lieu récemment à la fois sur la préparation des échantillons (notamment les techniques de deutération) ainsi que sur l'instrumentation.Ce travail décrit l'application de techniques qui mettent en œuvre deux procédés de diffraction des neutrons et des rayons-X. En particulier, l'utilisation de la cristallographie des neutrons et l'analyse spectroscopique in crystallo appliqué sur des cibles biologiques sélectionnées est développé pour un certain nombre de systèmes clés. L'optimisation de protocoles et le développement de nouveaux outils ont été exploré, afin d'effectuer conjointement de la cristallographie macromoléculaire à haute résolution aux neutrons et aux rayons X. Dans ce contexte, un nouveau système de montage cristallographique, totalement compatible avec les techniques de diffraction aux neutrons et aux rayons X, a été développé dans le but de réaliser les expériences souhaitées.La spectroscopie UV-vis et Raman in crystallo ont été utilisées pour contrôler la formation d'un produit de réaction directement dans les cristaux. Certaines méthodologie sur la congélation ainsi que sur la croissance de grand cristaux ont été effectuée afin d'acquérir suffisamment de données pour établir un protocole qui pourrait être appliquée en routine pour des expériences de diffraction de neutrons cryogéniques. Les méthodes et la technologie développée à l'intérieur de ce projet ont conduit à la détermination d'une structure cristalline aux neutrons de la trypsine en complexe avec son substrat, le Suc-RRMA-PNA, les collectes de données ont été effectuée à température cryogénique.En outre, nous avons concentrés notre attention sur deux enzymes spécifiques impliquées dans la production de tréhalose dans le microorganisme Deinococcus radiodurans – la maltooligosyltrehalose trehalosynthase (MTSase) et la maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (MTHase). Ces deux enzymes sont capables de dégrader l'amidon soluble et les polysaccharides linéaires en trehalose, qui est un disaccharide connu pour ses propriétés protectrices des protéines et des membranes cellulaires. Dr-MTSase catalyse une transglycosylation intramoléculaire afin de transformer le maltopentaose en maltotriosyltréhalose, tandis que la Dr-MTHase reconnaît et clive spécifiquement les substrats maltotriosyltréhalose afin de libérer le tréhalose. La nouvelle structure de la Dr-MTSase a été déterminée dans sa forme apo et en complexe avec différents substrats de sucre; en outre, la caractérisation enzymatique et une description de son mécanisme de réaction sont rapportés. Enfin, la croissance de gros cristaux perdeutéré et l'analyse spectroscopique de la liaison du Dr-MTHase en complexe avec son substrat, le maltopentaose, ont été réalisés en vue d'une prochaine expérience de diffraction des neutrons. / The importance of X-ray diffraction techniques for the determination of macromolecular structure in relation to biological function can be easily grasped when looking at the number of depositions in the Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb). Although over 100,000 X-ray structures now exist in the database, the study of biological macromolecules with neutron diffraction techniques has been more limited. However those studies that have been performed clearly illustrate that neutron macromolecular crystallography can provide powerful complementary information to that gained from X-ray studies, and major developments have occurred in the recent past both for sample preparation (notably deuteration techniques) and for instrumentation.This work describes the application of techniques that strongly implement both neutron and X-ray diffraction techniques. In particular, the use of neutron crystallography and in crystallo spectroscopic analysis applied on selected biological targets was developed for a number of key systems. The optimization of protocols and the development of new tools to perform high-resolution joint neutron and X-rays macromolecular crystallography, has been explored. In this context a novel crystallographic mounting system, totally compatible with joint neutron and X-ray diffraction techniques, was developed in order to perform the desired experiments.UV-vis and Raman in crystallo spectroscopy has been applied to monitor reaction product formation directly in crystals. Some methodology on large crystal growth and freezing has been performed in order to acquire sufficient data to establish a protocol that could be routinely applied for neutron cryogenic diffraction experiments. The methods and the technology developed inside this project led to the determination of a novel neutron crystal structure of trypsin in complex with the substrate suc-AAPR-pNa, with data collection performed at cryogenic temperature.Further, we focussed our attention on two specific proteins involved in the production of trehalose in the microorganism Deinococcus radiodurans - the maltooligosyltrehalose trehalosynthase (MTSase) and the maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (MTHase) enzymes. These two enzymes are able to breakdown soluble starch and linear polysaccharides into trehalose, which is a disaccharide known for its protective properties of proteins and cell membranes. Dr-MTSase catalyzes an intramolecular transglycosylation in order to transform maltopentaose into maltotriosyltrehalose, while Dr-MTHase recognises and cleaves specifically maltotriosyltrehalose substrates in order to release trehalose. The novel structure of Dr-MTSase has been determined in its apo form and in complex with different sugar substrates; furthermore the enzymatic characterization and description of its reaction mechanism are reported. Finally the growth of large perdeuterated crystals and the spectroscopic analysis of substrate binding of Dr-MTHase in complex with maltopentaose, have been performed in preparation of a forthcoming neutron diffraction experiment.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015GREAV062 |
| Date | 23 November 2015 |
| Creators | Romoli, Filippo |
| Contributors | Grenoble Alpes, Forsyth, Trevor, De Sanctis, Daniele |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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