Fibrillin proteins are the major components of microfibrils in elastic and non-elastic extracellular matrices. Microfibrils exert critical functions in the development and homeostasis of tissues and organs. Mutations in fibrillin-1 lead to heritable diseases such as Marfan syndrome, Weill-Marchesani syndrome and others. While different studies have been performed to characterize human fibrillins in details, mouse fibrillins have not yet been studied in depth. In this thesis, recombinant expression plasmids for the C-terminal halves of mouse fibrillin-1 and -2 were generated. The recombinant proteins were expressed in human embryonic kidney cells, and subsequently purified by immobilized metal ion affinity chromatography. N-terminal sequencing validated the correct sequence of the recombinant proteins. Both purified mouse fibrillin fragments consistently presented in monomeric, intermediate and multimeric forms. Similar to human fibrillins, the mouse fibrillin-1 and -2 fragments showed strong interaction with heparin in solid phase binding assays. Addition of the recombinant mouse fibrillin-1 C-terminal fragment to fibroblasts inhibited mouse microfibril assembly. The recombinant mouse fibrillin fragments were used to generate rabbit antisera, which were extensively characterized. Both antisera had very high titers against the mouse fibrillin fragments as determined by ELISA. As expected, based on the >95% homology on the amino acid level, the antisera showed high cross-reactivity between the mouse and human fibrillin-1 and -2 fragments. Surprisingly, however, the antiserum against mouse fibrillin-1 reacted much more strongly with microfibrils produced from mouse cells and with mouse tissue compared to the antiserum against human fibrillin-1. / Les fibrillines sont les principaux composants des microfibrilles dans les matrices extracellulaires élastiques et non élastiques. Les microfibrilles jouent un rôle majeur dans le développement et l'homéostasie des tissus et des organes. Des mutations dans la fibrilline-1 causent des maladies héréditaires telles que le syndrome de Marfan, le syndrome de Weill-Marchesani et autres.. Alors que de nombreuses études ont été menées afin de caractériser les fibrillines humaines, les fibrillines murines n'ont été que partiellement étudiées.Dans cette thèse, des plasmides permettant l'expression des portions C-terminales des fibrillines 1 et 2 de souris ont été générés. Les protéines recombinantes ont été exprimées dans les cellules de rein embryonnaire humain, et ensuite purifiées par chromatographie d'échange ionique. La séquence des protéines recombinantes a été validée par séquençage N-terminal . Les deux fragments de fibrilline de souris purifiés se présentaient sous des formes monomériques, intermédiaires et multimèriques. Tout comme les fibrillines humaines, les fragments de fibrilline1 et 2 ont montré une forte interaction avec l'héparine dans les essais de liaison protéine-protéine en phase solide. L'addition du fragment C-terminal de fibrillin 1 de souris à des fibroblastes induit l'inhibition de l'assemblage des microfibrilles. Les fragments de fibrillines recombinantes de souris ont également été utilisés pour générer des antisérums de lapin, qui ont été largement caractérisés. Des tests ELISA ont montré une forte réactivité des deux antisérums contre les fragments de fibrilline de souris. Comme la forte homologie au niveau peptidique (95%) le laissait supposer, les antisérums ont montré une forte réactivité croisée entre les fragments de fibrillines 1 et 2 murins et humains. Cependant, l'antisérum contre la fibrilline-1 de souris réagissait plus fortement à des microfibrilles produites à partir de cellules de souris et avec des tissus murins comparé à l'antisérum dirigé contre la fibrilline-1 humaine.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.123010 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Pham, Nguyen Hong |
| Contributors | Dieter Reinhardt (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Anatomy and Cell Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically submitted theses |
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