Fibrillin-1 is the major backbone of extracellular matrix microfibrils throughout many tissues. Genetic mutations in fibrillin-1 can lead to Marfan syndrome (MFS), characterized by vascular, ocular and skeletal phenotypes. To investigate structural and functional disparities between fibrillin-1 polypeptide fragments harboring point mutations leading to classical and neonatal MFS, mutations were generated in recombinant expression plasmids and transfected into mammalian cells. The recombinant proteins were purified by low pressure liquid chromatography (LPLC). Proteolytic susceptibility assays, using physiological and non-physiological proteases, demonstrated that mutations resulting in neonatal MFS were more susceptible to proteolytic cleavage when compared to classical mutations and non-mutated controls. N-terminal sequencing of resulting fragments revealed cleavage sites close to the mutation sites. Circular dichroism spectroscopy revealed that the mutations did not significantly destabilize the overall structure of the mutant polypeptides compared to wild-type. This work suggests that proteolytic susceptibility of mutated fibrillin-1 correlates with the clinical severity observed for classical and neonatal MFS. / Fibrilline-1 constitue le squelette des microfibrilles de la matrice extracellulaire à travers de nombreux tissus. Des mutations génétiques dans cette protéine peuvent causer le syndrome de Marfan, qui se caractérise par des phénotypes vasculaires, oculaires, et squelettiques. Deux formes de ce syndrome existe : la forme classique et la forme néonatale. Pour examiner les différences structurelles et fonctionnelles entre les mutations faux-sens causant le syndrome de Marfan classique et celles causant la forme néonatale, des protéines recombinantes mutantes ont été générées dans des plasmides d'expression, puis transfectées dans des cellules mammaliennes, avant d'être purifiées par chromatographie en phase liquide à basse pression. L'hypersensibilité de chaque mutant à la dégradation protéolytique a été testée par des protéases. Cet essai a démontré que les mutations causant le syndrome néonatal de Marfan était plus sensible à la dégradation protéolytique que les mutations causant le syndrome classique ou que la protéine non mutée. Le séquençage de l'extrémité N-terminale des fragments protéolytiques démontra plus de sites de segmentation à proximité de la mutation. Le dichroïsme circulaire révéla que les mutations n'avaient pas affecté de façon significative la structure générale de la protéine comparée au phénotype sauvage. Cette étude suggère que l'hypersensibilité de la protéine fibrilline-1 mutante correspond à la sévérité clinique observée entre les syndromes de Marfan classique et néonatal.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.86848 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Kirschner, Ryan |
| Contributors | Dieter Reinhardt (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Faculty of Dentistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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