The available antibodies against CFTR are not sensitive enough to detect CFTR at endogenous or near endogenous levels making detection at native levels difficult. We raised two monoclonal antibodies, 22E8 and 23C5, against the R domain of human CFTR with the goal of identifying an antibody sensitive enough to detect CFTR in native airway cells. These antibodies were characterized for their ability to detect over-expressed as well as endogenous levels of CFTR in immunoblotting, immunoprecipitation and immunofluorescence. Their ability to detect CFTR was also compared with commercial antibodies M3A7 and 24-1. We show that 23C5 and 22E8 are more sensitive than the commercial antibodies and are able to detect CFTR in over-expressed and endogenous cells by immunoblotting. However, only 23C5 is able to immunoprecipitate CFTR and neither is able to detect CFTR in native airway cells by immunoblotting or are suitable for immunofluorescence. These antibodies will enable studies of CFTR biogenesis in endogenous cells. / A l'heure actuelle les anticorps dirigés contre la protéine CFTR ne sont pas suffisamment sensibles pour détecter cette protéine de facon endogène rendant ainsi l'étude de cette protéine difficile dans les tissus. Notre laboratoire a fabriqué deux anticorps monoclonaux , nommés 22E8 et 23C5, dirigés contre le domaine R de la protéine CFTR. L'abilité de ces anticorps à détecter l'expression de CFTR que ce soit de façon endogène ou lorsque la protéine est surexprimée a été testée à l'aide des techniques d'immunoblotting, d'immunoprécipitation et d'immunofluorescence. Afin de verifier leur sensibilité et leur capacité à détecter la protéine CFTR, ces anticorps ont été comparés aux anticorps M3A7 et 24-1 qui sont disponibles dans le commerce et connus pour détecter de facon optimale la protéine CFTR. Les resultats obtenus dans les lignées cellulaires à l'aide de la technique d'immunoblotting ont permis de montrer que les anticorps 23C5 et 22E8 sont plus sensibles que les anticorps commerciaux, de plus ils sont capables de détecter à la fois les protéines endogènes et sur-exprimées. Bien que l'anticorps 23C5 soit capable d'immunoprécipiter la protéine CFTR, aucun des deux anticorps n'a permis la detection de la protéine CFTR par immunoblotting dans les cellules de culture primaire. De plus, ces anticorps n'ont pas permis la detection de la protéine CFTR par immunofluorescence. Ainsi l'utilisation de ces anticorps nous donnera l'opportunité d'étudier la protéine CFTR dans les cellules l'exprimant de facon endogène afin de mieux comprendre sa regulation et son traffic.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.66882 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Mirza, Myriam |
| Contributors | David Thomas (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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