Increasing number of observations indicate that RNA interference (RNAi) may be used by mammalian cells to counteract virus infection as a natural innate immunity. The human immunodeficiency virus (HIV-1) TAR RNA binding protein (TRBP) interacts with Dicer and is a component of the RNA-induced silencing complex (RISC). In humans, while Dicer alone can process double-stranded (ds) RNAs and pre-micro (mi)RNAs efficiently, the recruitment of the short interfering (si)RNA/miRNAs to Ago2 requires TRBP. TRBP is a dsRNA binding protein that increases translation from HIV TAR containing RNAs by a direct binding to the structured TAR RNAs and by inhibiting the protein kinase PKR. The relationship between its activity on HIV gene expression and on RNAi has not been studied. Using the two-hybrid method we identified the specific region of interaction in the C-terminal part of TRBP and in the N-terminal part of Dicer. This interaction between both endogenous proteins was further confirmed by immunoprecipitation and colocalization in human cells. TRBP's requirement in the RNAi pathway was shown by an assay in HeLa, Astrocytes and Tarbp2 -/- cells using a green fluorescent protein-expressing plasmid and either short hairpin (sh)- or mi-RNAs against GFP. RNAi is decreased in Tarbp2 -/- mouse cells and Astrocytes. Results using a dual luciferase assay show that HIV-1 disrupts the RNAi mechanism in mammalian cells and that HIV-1 products Tat protein, TAR and RRE RNAs mediate this suppression. In addition, we show that HIV infection has no effect on the interaction between TRBP, Dicer and Ago2 in human cells. Even though the RNAi pathway is functional in human cells, HIV has found the way to repress this mechanism. Whether HIV-1 is able to disrupt the function of RISC to avoid an innate immunity response or whether it co-opts the RNAi pathway for its benefit remains to be elucidated. / Un grand nombre d'observations indiquent que l'interférence à ARN (RNAi) peut être utilisée comme une réponse naturelle innée dans des cellules de mammifère pour contrer l'infection virale. La protéine liant l'ARN TAR du virus d'immunodéficience humaine (VIH) (TRBP) est une composante du complexe de mise en silence induit par l'ARN (RISC), tel que démontré par son interaction avec Dicer. Bien que Dicer seul puisse cliver les ARNs double brin (db) et les pre-micro (mi)RNAs efficacement, le recrutement de « short interfering » (si)RNA/miRNAs à Ago2 a besoin de TRBP. TRBP, une protéine capable de lier l'ARN db, peut accroître la traduction du VIH contenant des ARNs TAR en se liant directement aux ARNs TAR structurés et en inhibant la protéine kinase PKR. La relation entre l'activité sur l'expression des gènes du VIH et la RNAi n'a pas encore été étudiée. En utilisant la méthode du double-hybride, nous avons identifié les régions spécifiques d'interaction dans la partie C-terminale de TRBP et dans la partie N-terminale de Dicer. On a confirmé l'interaction entre les deux protéines endogènes par immunoprecipitation et colocalisation dans des cellules humaines. On a montré que la voie de RNAi a besoin de TRBP, par un essai fonctionnel dans des cellules HeLa, des Astrocytes et des cellules de souris Tarbp2 -/- en utilisant des plasmides codant pour la fluorescence verte (GFP) et des short hairpin (sh)- ou miRNAs contre la GFP. La RNAi diminue dans des cellules de souris Tarbp2 -/-. Un essai de double luciférase démontre que le VIH supprime le mécanisme de RNAi dans des cellules humaines ainsi par l'intermédiaire de sa protéine Tat et de ses ARNs TAR et RRE. De plus, on démontre que l'infection par le VIH n'a pas d'effet sur l'interaction entre TRBP, Dicer et Ago2 dans les cellules humaines. Donc, même si la voie de RNAi est fonctionnelle chez l'humain, le VIH a trouvé des moyens pour supprimer ce mécanisme. Que le VI
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.18680 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Melendez Pena, Carlos |
| Contributors | Anne Gatignol (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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