Enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli (EPEC and EHEC) are Gram-negative pathogens that cause diarrheal disease in the developed and developing world. To cause infection, these pathogens must overcome innate host defenses, such as secreted cationic antimicrobial peptides (AMPs). There are two groups of human AMPs: cathelicidins (LL-37) and defensins (α-defensin 5). AMPs are expressed in specific locations of the human body. In the small intestine, the infectious niche for EPEC, human α-defensins 5 and 6 (HD-5 and HD-6) are abundant and there are low levels of LL-37. Conversely in the colon, the infectious niche for EHEC, HD-5 and HD-6 are not expressed and LL-37 is abundant. Pathogens can overcome AMP-killing using several mechanisms, including proteolytic inactivation, producing shielding structures and modifying their lipopolysaccharide (LPS). We hypothesized that EPEC and EHEC use AMP-resistance mechanisms to resist killing by secreted AMPs during infection. Previously, CroP the omptin protease in Citrobacter rodentium, a murine pathogen used to model EPEC and EHEC infections, was shown to degrade murine cathelicidin. Both EPEC and EHEC have a CroP-homologue: OmpT. The contribution of OmpT to LL-37 resistance was analyzed in both pathogens. Peptide cleavage assays showed that EHEC OmpT cleaves and inactivates LL-37 more rapidly than EPEC OmpT. Higher ompT-expression and protein levels in EHEC than EPEC are responsible for the differences observed in LL-37 inactivation rates. Additional studies showed that OmpT was unable to cleave folded α-defensins. These data suggest that EPEC uses other mechanisms to resist killing by the AMPs in its infectious niche. To assess this possibility, surface structures that may shield the bacterial membrane from AMPs were identified. High transcript levels of gfcA, a gene required for group 4 capsule (G4C) secretion, were observed in EPEC but not EHEC. The unencapsulated EPEC ΔgfcA and EHEC wild-type strains were more susceptible to HD-5 killing than EPEC wild-type. Since the G4C is composed of the same sugar repeats as the LPS O-antigen, an O-antigen ligase (waaL) deletion mutant was generated to assess the role of the O-antigen in HD-5 resistance. The EPEC ΔwaaL strain was more susceptible to HD-5 than both the wild-type and ΔgfcA strains. Addition of exogenous polysaccharide increased survival of the ΔgfcAΔwaaL strain in the presence of HD-5, suggesting that HD-5 binds the polysaccharides present on the surface of EPEC. These data show that EPEC relies on both the G4C and O-antigen to resist the bactericidal activity of HD-5. Altogether, these data indicate that EHEC and EPEC differentially regulate AMP-specific resistance mechanisms as an adaptation to their specific infectious niches. / Les Escherichia coli entéropathogènes et entérohémorrhagiques (EPEC et EHEC) sont des bactéries à coloration Gram-négative qui causent des diarrhées dans les pays développés et en développement. Pour causer une infection, ces pathogènes doivent surmonter les défenses de l'immunité innée de l'hôte, tel que les peptides antimicrobiens sécrétés (PAMs). Chez l'humain, les PAMs sont divisés en deux groupes, les cathélicidines (ex. LL-37) et les défensines (ex. α-défensine humaine 5). L'expression des PAMs varie selon les tissus. Dans l'intestin grêle, la niche infectieuse des EPEC, les α-défensines humaines 5 et 6 (HD-5 et HD-6) sont abondantes et le niveau de LL-37 est bas. Inversement, HD-5 et HD-6 ne sont pas exprimées dans le côlon, la niche infectieuse des EHEC, et LL-37 est très abondant. Les pathogènes peuvent résister aux PAMs en utilisant différent mécanismes comme l'inactivation protéolytique, la production de structures recouvrant la cellule bactérienne et la modification du lipopolysaccharide (LPS). Notre hypothèse est que les EPEC et EHEC utilisent des mécanismes de résistance aux PAMs pour établir une infection. Précédemment, il a été démontré que la protéase de type omptin, CroP, de Citrobacter rodentium, un pathogène murin utilisé comme modèle pour les infections des EPEC et EHEC, dégrade la cathélicidine murine. Les EPEC et EHEC possèdent un homologue de CroP, OmpT. La contribution de OmpT à la résistance au LL-37 a été examinée chez ces deux pathogènes. Nos tests de clivage de peptide ont démontré que EHEC OmpT clive et inactive LL-37 plus rapidement que EPEC OmpT. La différence observée a été associée à une plus forte expression et production de OmpT chez les EHEC que chez les EPEC. Des tests supplémentaires ont démontré que OmpT ne peut pas cliver les α-défensines repliées. Ces données suggèrent qu'EPEC utilise d'autres mécanismes de résistance pour surmonter l'activité des PAMs présents dans sa niche infectieuse. Pour tester cette possibilité, les structures recouvrant la cellule ont été identifiées. Un haut niveau de transcription de gfcA, un gène requit pour la sécrétion de la capsule du groupe 4 (G4C), a été observé chez EPEC mais pas chez EHEC. Le mutant EPEC non-encapsulé ΔgfcA et la souche sauvage EHEC sont plus susceptible à l'effet du HD-5 que la souche sauvage EPEC. Étant donné que la G4C est composée des mêmes sucres que l'antigène O, la ligase de l'antigène O, waaL, a été délétée pour déterminer le rôle de l'antigène O dans la résistance au HD-5. La souche EPEC ΔwaaL est plus susceptible au HD-5 que la souche sauvage EPEC et le mutant EPEC ΔgfcA. L'addition de polysaccharide exogène augmente la survie du mutant ΔwaaLΔgfcA en présence de HD-5. Ceci indique que HD-5 se lie aux polysaccharides présents à la surface des EPEC. Ces données démontrent que la résistance à HD-5 chez EPEC repose sur la présence de la G4C et de l'antigène O. Toutes ces données indiquent que EHEC et EPEC utilisent des mécanismes de résistance différents aux PAMs, ce qui démontre une adaptation à leurs niches infectieuses respectives.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.121462 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Thomassin, Jenny-Lee |
| Contributors | Herve Le-Moual (Supervisor1), Samantha Gruenheid (Supervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses |
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