MiRNAs are relatively small (21-23 nucleotide), single-stranded, evolutionarily conserved, non coding RNA molecules that usually inhibit mRNA expression or protein translation and thereby regulate gene expression. Angiopoientin-1 (Ang-1), along with its receptors Tie-1 and Tie-2, play a major role in Angiogenesis, the sprouting of new blood vessels. We first exposed endothelial cells (ECs) to Ang-1 for 12, 24, and 48h and assessed the expression of human miRNAs using Affymatrix arrays. Our results revealed that Ang-1 exposure elicits significant changes in miRNA expression with numerous miRNA being downregulated and only few miRNAs which were upregulated. One miRNA (miR-146b-5p) was significantly upregulated in ECs exposed to 12, 24, and 48h of Ang-1. This miRNA is a well-known regulator of innate immune responses and has been described to significantly inhibit the expression of IRAK1 and TRAF6 proteins which are involved in Toll-like 4 receptor signaling. Ang-1 exposure for 12hr triggered significant rise in the expression of 9 miRNAs while exposure to Ang-1 for 24 and 48h elicited a significant increased in the expression of 8 and 15 miRNAs, respectively. Exposure to Ang-1 also triggered significant inhibition of the expression of 14, 6, and 7 miRNAs after 12, 24 and 48h of exposure, respectively. The majority of these miRNAs have not been well characterized in terms of specific molecular targets or biological responses. In our subsequent experiments, we focused our attention on the biological roles of 8 miRNAs whose expression is downregulated by Ang-1. Our hypothesis was that these miRNAs exert a strong inhibitory influence on angiogenic processes and that their downregulation is essential for the pro-angiogenic effect of Ang-1 to be expressed. We used cell counting, caspase 3/7 activity assays, scratch healing assays, Matrigel® in vitro tube formation assays and cell cycle measurements to characterize the influence of several miRNAs on cell survival, apoptosis, migration, differentiation, and cell cycle regulation. Our results revealed that miR-1468, miR-1287, and miR-1233 significantly inhibit the pro-survival influence of Ang-1 on ECs, whereas miR-103, miR-330-5p, miR-557, miR-575 and miR-668 had no significant effects. In addition, these three miRNAs significantly attenuate EC migration, EC differentiation and impaired cell cycle progression. We conclude that several anti-angiogenic miRNAs are strongly downregulated in ECs exposed to Ang-1 and that this response is designed to promote the pro-angiogenic effects of Ang-1. / Les microARN (ou miARN) sont de courtes (21 à 23 nucléotides) molécules d'acide ribonucléique (ARN) à simple-brin, non codantes et évolutionairement conservées. Ces molécules servent à réguler l'expression génétique en inhibant l'expression d'ARN messagers ou la traduction de protéines. Nous avons d'abord exposé des cellules endothéliales (CE) à Angiopoeitin-1 (Ang-1) pendant 12, 24 et 48 heures pour ensuite évaluer l'expression des miARN humains avec des essais Affymatrix. Nos résultats révèlent que l'exposition à Ang-1 élicite des changements d'expression significatifs, puisque plusieurs miARN ont été diminués tandis que seulement quelques-uns ont été augmentés. L'expression de la molécule miR-146b-5p a été significativement accrue dans les CE exposées à Ang-1 pour 12, 24 et 48 heures. Ce miARN est un régulateur bien connu du système immunitaire et a été établi d'entraver l'expression des protéines IRAK1 et TRAF6 qui participent dans la signalisation du récepteur Toll-like 4 (TLR4). Le traitement avec Ang-1 de 12 heures a provoqué une augmentation signification de l'expression de 9 miARN, tandis que les traitements de 24 et 48 heures ont entrainé une hausse de l'expression de 8 et 15 miARN, respectivement. L'exposition à Ang-1 a aussi réduit l'expression de 14, 6 et 7 miARN suivant des traitements de 12, 24 et 48 heures, respectivement. La majorité de ces miARN n'ont pas encore été bien caractérisés en termes de cible moléculaires spécifiques ou de processus biologiques. Dans nos manipulations subséquentes, nous avons tourné notre attention vers les rôles biologiques de 8 espèces de miARN qui ont vu leur expression diminuée par Ang-1. Notre hypothèse était que ces miARN exercent une puissante influence inhibitoire sur les processus angiogéniques et que leur répression serait essentielle pour les effets pro-angiogéniques d'Ang-1. Nous avons compté les cellules, utilisé des essais d'activité Caspase 3/7, des tests de cicatrisation de plaie et de différenciation Matrigel, ainsi qu'effectué des mesures du cycle cellulaire pour déterminer l'influence de plusieurs miARN sur la survie des cellules, l'apoptose, la migration, la différenciation et la régulation du cycle cellulaire. Nos résultats démontrent que miR-1468 miR-1287 et miR-1233 inhibent significativement l'effet d'Ang-1 de promouvoir la survie des CE. De plus, ces 3 miARN ont significativement atténué la migration, la différenciation et la progression du cycle cellulaire des CE. Nous concluons que plusieurs miARN anti-angiogéniques sont réduits dans les CE exposés à Ang-1 et que cette réponse est conçue pour promouvoir les effets pro-angiogéniques de Ang-1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.123113 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Golyardi, Flora |
| Contributors | Sabah N A Hussain (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically submitted theses |
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