The level of bioavailable ferric iron (10-24 M Fe3+) in human serum is limited by its low solubility at physiological pH and by iron-binding host proteins. This situation poses a dilemma for bacteria; for survival, they must maintain an intracellular free iron concentration of 10-6 M. Gram-negative bacteria overcome iron limitation by producing siderophores that chelate iron with high affinity. Escherichia coli imports the siderophore ferrichrome via the TonB-dependent ferric hydroxamate uptake (Fhu) system. Extracellular ferrichrome is transported across the outer membrane (OM) through FhuA, a β-barrel receptor. The TonB–ExbD–ExbB complex provides energy for transport by harnessing the proton motive force across the cytoplasmic membrane (CM) and delivering it to the OM receptor. After passing through FhuA, ferrichrome is captured by the periplasmic binding protein FhuD and shuttled to the CM-embedded ABC transporter complex FhuB–FhuC. We previously demonstrated a novel interaction between FhuD and the energy transducer TonB. By phage display, we identified three well-defined regions of interaction on TonB to which FhuD was predicted to bind. To extend these studies, we utilized PSIPRED and SERp bioinformatics servers to identify areas on TonB that were unstructured and flexible. Redundant residues within the proline-rich region of TonB (residues 66-100) fit these criteria and were also not predicted to be necessary for complex formation with FhuD. A TonB construct lacking its proline-rich region, yet retaining its three predicted binding regions for FhuD, was engineered and purified to homogeneity. By ELISA, TonBΔ66-100 bound FhuD in a concentration-dependent manner, comparable to binding by full-length TonB. Surface plasmon resonance measured a binding affinity between FhuD and TonBΔ66-100 of 9 nM, consistent with data obtained for FhuD binding full-length TonB. Furthermore, presence of bound / La disponibilité du fer dans le sérum humain est limitée à 10-24 M de Fe3+. Ceci pose un dilemme pour les bactéries, car elles doivent en maintenir une concentration intracellulaire de 10-6 M pour survivre. Les bactéries Gram-négatives peuvent éviter cette limitation en produisant des sidérophores, capables de chélater le Fe3+ avec une grande affinité. Le ferrichrome, un sidérophore, est importé dans Escherichia coli par le système 'ferric hydroxamate uptake' (Fhu), qui dépend de la protéine TonB. Le ferrichrome extracellulaire est transporté à travers la membrane externe par FhuA, un tonneau β. Le complexe TonB–ExbD–ExbB fournit l'énergie nécessaire au transport via la force protomotrice. Le ferrichrome est capturé dans le périplasme par FhuD, pour être ensuite transloqué au complexe FhuB–FhuC, un transporteur de type ABC localisé dans la membrane interne. Notre groupe était la première à découvrir une interaction entre FhuD et TonB. Par la technique génétique moléculaire phage display, on a identifié trois régions sur TonB donc FhuD est prédit d'interagir. Nous avons généré un plasmide contenant TonB avec une délétion interne (résidus 66-100), qui est identifiée comme non structurée et très entropique par les programmes bioinformatiques PSIPRED et SERp. Une forme de TonB sans cette région (TonBΔ66-100) a été purifiée à l'homogenéité par chromatographie d'affinité. Nous avons observé que TonBΔ66-100 se lie à FhuD, comme sa contrepartie complète, par ELISA et par résonance plasmonique de surface (SPR), avec une affinité de liaison de 9 nM. Aussi, cette liaison n'était pas dépendente sur la présence de sidérophore. Cependant, la liaison entre FhuD et TonB n'est pas affectée par l'élimination de la région flexible riche en prolines de cette dernière. Ces résultats approfondissent la description de cette interaction critique de prot
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.66873 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Deme, Justin |
| Contributors | James W Coulton (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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