Group II (GII) introns are large ribozymes that can autocatalytically excise themselves from pre-mRNA transcripts. They are found in bacteria, archaea, and the organelles of lower eukaryotes and land plants. GII introns contain all the necessary components for splicing, but protein splicing factors are essential to induce proper tridimensional folding of these intron RNAs in vivo. GII introns in bacteria and archaea usually encode their own splicing factor, termed the intron-encoded protein (IEP). In contrast, most GII introns in land plants do not encode an IEP. Instead, such GII introns depend on a diverse set of RNA-binding proteins to act as splicing factors. We aim to explore the potential diversity of group II intron splicing factors in bacteria.We study the model group II intron Ll.LtrB, from the Gram-positive bacterium Lactococcus lactis. Ll.LtrB encodes the IEP LtrA, which is essential for efficient and accurate splicing. Ll.LtrB interrupts the gene coding for the relaxase enzyme (LtrB), necessary to initiate the transfer of conjugative elements in L. lactis. Since ligation of ltrB exons is necessary for conjugation, splicing efficiency of Ll.LtrB from the ltrB pre-mRNA controls the transfer efficiency of conjugative elements. We took advantage of this relationship to develop a sensitive conjugation assay to study a splicing-deficient mutant of Ll.LtrB, which lacks LtrA (Ll.LtrBΔLtrA). Previously, a genomic expression library of L. lactis was generated in a conjugative plasmid. A conjugation assay was performed and led to the selection of three plasmids containing genomic fragments (Lib7,9,11) that can rescue conjugation efficiency in the absence of LtrA (Ll.LtrBΔLtrA).Lib11 encodes five putative open reading frames (ORFs) and two partial ORFs. We used two different strategies to determine which ORFs may be responsible for the observed increase in conjugation efficiency, and hence splicing rescue. First, we expressed individual ORFs from a conjugative plasmid. Second, we knocked out expression of individual ORFs within the original Lib11 construct. From these strategies, ORF1 was determined to increase conjugation efficiency, but the effect was variable. Similarly, further studies revealed that Lib11-containing strains also displayed variable levels of conjugation. We thus performed a series of control conjugations and identified conditions in which the variability in conjugation efficiency is reduced. We can now identify which of the ORFs is responsible for the increase in conjugation efficiency. / Les introns de groupe II sont de grands ribozymes qui s'épissent des transcrits pré-ARNm par eux mêmes de façon autocatalytique. Ils sont présents chez les bactéries, les archaebactéries et dans les organelles des eucaryotes inférieures et des plantes terrestres. Les introns de groupe II contiennent toutes les composantes nécessaires pour leur épissage, par contre, des facteurs d'épissage protéique sont essentiels in vivo pour induire le repliement tridimesionnel approprié de ces ARNs intronique. Les introns de groupe II chez les procaryotes encodent leurs propres facteurs d'épissage appelé protéine encodé dans l'intron (IEP). En revanche, la majorité des introns de groupe II dans les plantes à fleurs n'encodent pas une IEP. Au lieu, ces introns de groupe II dépendent d'un groupe divers de protéines liant l'ARN pour jouer le rôle de facteurs d'épissage. Notre but est d'explorer la diversité potentielle des facteurs d'épissage d'intron de groupe II chez les bactéries. Nous étudions l'intron de groupe II modèle Ll.LtrB de la bactérie à Gram positif Lactococcus lactis. Ll.LtrB encode la PEI LtrA qui est essentielle pour son épissage efficace et précis. Ll.LtrB interrompt le gène codant pour l'enzyme relaxase (LtrB) requise pour initier le transfert d'éléments conjugatifs chez L. lactis. Étant donné que la ligature des exons du gène ltrB est requise pour la conjugaison, l'efficacité d'épissage de Ll.LtrB du pré-ARNm de ltrB contrôle l'efficacité de transfert des éléments conjugatifs. Nous avons pris avantage de ce lien pour développer un essai de conjugaison sensible pour étudier un mutant de Ll.LtrB qui manque LtrA (Ll.LtrBΔLtrA) et qui ne peut s'épisser. Une banque d'expression génomique a précédemment été générée dans un plasmide conjugatif. Un essai de conjugaison a été effectué et a mené à la sélection de trois plasmides contenant des fragments génomiques (Lib7,9,11) qui peuvent secourir l'efficacité de conjugaison en l'absence de LtrA.Lib11 encode cinq cadres de lecture ouverts potentiels (ORFs) et deux ORFs partiels. Nous avons utilisés deux stratégies différentes pour déterminer quels ORFs peuvent être responsables de l'augmentation de l'efficacité de conjugaison observé et donc de secourir l'épissage. Premièrement, nous avons aboli l'expression des ORFs individuellement à partir d'un plasmide conjugatif. Deuxièmement, nous avons aboli l'expression des ORFs individuellement dans la construction originale, Lib11. De ces deux stratégies nous avons déterminé qu'ORF1 augmente l'efficacité de conjugaison mais que l'effet est variable. De façon similaire, d'autres études ont révélé que les souches qui contiennent Lib11 démontrent aussi un niveau de conjugaison variable. Nous avons donc réalisé une série de conjugaisons contrôles et identifié des conditions ou la variabilité de l'efficacité de conjugaison est réduite. Nous pouvons maintenant identifier quels ORFs sont responsables pour l'augmentation de l'efficacité de conjugaison.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.107902 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Narcross, Lauren |
| Contributors | Benoit Gilbert Cousineau (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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