A major feature of Gram-negative bacteria is that the outer-membrane (OM) does not have an energy source to regulate active transport of nutrients; instead it relies on energy from the cytoplasmic membrane (CM) to accomplish this. The energy-transducing complex of TonB–ExbB–ExbD in the CM helps overcome this obstacle in TonB-dependent transport systems. In order to further understanding of this multi-component complex, ExbD was purified for use in phage display (PD) experiments to predict interacting partners and to identify sites of interaction with other members of the complex. Surface plasmon resonance (SPR) was carried out to biochemically validate PD predictions. Affinity-selected peptides from two commercial PD libraries predicted interactions between ExbD–ExbD and ExbD–TonB. No interaction between ExbD–ExbB was predicted. Notably, an interaction was predicted between ExbD and the periplasmic binding protein BtuF of the vitamin B12 transport system. SPR experiments validated the prediction of interactions between ExbD and TonB. Interaction between ExbD–ExbB was not apparent. Additionally, TonB–ExbB and ExbB–ExbB interactions were observed. Multi-component SPR analyses suggested that ExbB and ExbD bind to unique sites on TonB suggesting the role of primary scaffold for TonB in the complex. / L'un des traits distinctifs de la membrane externe des bactéries gram-négatives est son dénuement de toute source d'énergie permettant le transport actif des nutriments. Ces bactéries font plutôt appel à l'énergie disponible à la membrane cytoplasmique. Localisé à la membrane cytoplasmique, le complexe de transduction de l'énergie formé des protéines ExbB, ExbD et TonB permet de surmonter cet obstacle dans les systèmes de transport TonB-dépendants. Dans le but d'avancer notre compréhension de ce complexe multi-protéique, nous avons purifié ExbD et l'avons soumis à des expériences de présentation de phage (PP) avec pour objectif de prédire certains de ses partenaires d'interaction et aussi afin d'identifier ses sites de contact avec les autres membres du complexe. Nous avons fait appel à la résonance plasmon de surface (RPS) pour valider nos résultats de PP.Nous fîmes usage de deux librairies de phages disponibles commercialement, grâce auxquelles nous pûmes prédire qu'ExbD interagit avec TonB ainsi qu'avec lui-même. Il nous a cependant été impossible de prédire une interaction entre ExbD et ExbB. Fait digne de mention, nos résultats prédisent une interaction entre ExbD et la protéine périplasmique BtuF impliquée dans le transport de la vitamine B12. Par ailleurs, la RPS permit de confirmer l'interaction entre ExbD et TonB prédite par PP. Par contre, aucune interaction ne put être observée à l'interface ExbB-ExbD. En outre, il nous a été possible d'observer des interactions entre ExbB et ExbB ainsi qu'entre ExbB et TonB. Finalement, une analyse RPS multi-composants a permis de suggérer que les interactions observées entre TonB et ses partenaires ExbB et ExbD ont lieu par l'intermédiaire de points de contact différents, appuyant par la même l'hypothèse d'un rôle central de protéine-échafaudage pour TonB dans le complexe.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.67043 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Levey, Kristian |
| Contributors | James W Coulton (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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