Staphylococcus aureus has become a major concern in public health and dairy industry due to the rapid evolution of host/organ specialized lineages adapted to humans and major food animals. However, the mechanism(s) of host- and organ-specialization as well as the distribution of dominant clonal lines of S. aureus is presently ill-defined. We hypothesized that coding repeat markers in the intragenic region of clumping factor A (clfA) gene would be capable of detecting and grouping adaptive clones and revealing predominant types and that whole genome expression of these clones in mammary mimicked reduced oxygen condition would potentially reveal subsets of gene(s) responsible for pathways and mechanisms of host-specialization and selection in the mammary gland. Thus, the suitability of clfA was explored. Results indicated that 80% of clfA analyzed had repeat-copies between 44 and 57. Furthermore, human isolates were polymorphic, while mastitis isolates were clonal. The repeats were stable during passages in milk, nutrient broth, and invasion of mammary cells showing suitability for typing. In addition, dominance of a clonal motif in mastitis implied organ-specific selection in the mammary gland. This was further examined in isolates from different organs in human patients and from bovine mastitis. The results showed significant correlation between the organs sampled and the length of clfA. Twenty out of the 23 sputum isolates had lower copy-numbers of 43-48, while 21 out of the 24 skin isolates had 55-63 copies. Moreover, sequence alignments and phylogenetic analysis placed isolates from different hosts and organs into respective clusters. / Subsequently, clfA was used as a typing marker for mastitis in a comparative experiment with pulsed-field gel-electrophoresis (PFGE) and spa typing, and identified genotype distributions and the dominant types across Canada. Interestingly, both clfA and PFGE had identical index of discrimination of 0.9. Two dominant PFGE lineage Groups A with 48.3% and D with 43.7 % represented Eastern and Western Canada strain types, respectively. These were further subdivided by clfA into four dominant subtypes X, Q, C, and Z which formed 82% and 43% of PFGE groups A and D, respectively. Thus, concordant with PFGE, clfA typing proved useful in rapidly profiling subpopulations with comparable discriminatory power. / Consequently, two isolates representing major human- and bovine-specific clones were used for whole genome expression after their invasion into mammary epithelial cells under normal and reduced oxygen conditions, using high-throughput genome qRT-PCR. In the mastitis isolate under normal oxygen, expression of MerR, sigB, VraS, YycG/YycF, araC, and tetR indicated adaptation, environmental sensing, binding, and protection. Coupling of fermentative metabolism to virulence was evident by upgulation of the catabolite control protein A (ccpA), pentose monophosphate pathway, and down regulation of TCA cycle. Invasive phenotypes, potentially through sarU activation of agr and in vivo viability factors as staphopains and GntR operon, also occurred. However, under reduced oxygen it showed upregulation of fibrinogen-binding, isd operon, (isdA, isdC, isdH), and sdrH, indicating aggressive binding phenotype. Irrespective of oxygen, strain Wright was less aggressive than the mastitis isolate and showed intense intracellular signalling potentially through MerR and sigB, limited toxins, and many hypothetical genes. Interestingly, under reduced oxygen, universal down regulation in metabolic and regulatory pathways occurred showing persistence of Wright strain. Taken together, the quick response of the mastitis isolate strongly suggested adapted phenotype to mammary cells and that reduced oxygen induced persistence properties. Future annotation of hypothetical proteins would potentially reveal a more precise network of regulatory subsets that are expressed in the mammary gland. / Staphylococcus aureus est un problème majeur tant pour la santé publique que pour l'industrie laitière à cause de la rapide évolution de lignées spécialisées hôte/organe touchant l'Homme et les animaux à destiné alimentaire. Cependant, les mécanismes de spécialisation hôte/organe ainsi que la distribution de ses lignées clonales dominantes restent mal décrites. Nous avons postulé l'hypothèse que des marqueurs codants répétés dans la région intra-génique du facteur d'agglutination clfA permettraient de détecter et d'attribuer un groupe à des clones adaptatifs et d'en révéler ainsi les types prédominants et que l'étude de l'expression génomique totale de ces clones dans des conditions reproduisant celles de glandes mammaires privées d'oxygène pourrait potentiellement révéler des sous-groupes de gènes impliqués dans les mécanismes de spécialisation hôte et de sélection dans les glandes mammaires. Nous avons donc étudié le gène clfA et nos résultats indiquent que 80% des gènes clfA analysés avaient entre 44 et 57 copies-répétées. De plus, les isolats humains étaient polymorphiques alors que ceux provenant de mastite étaient clonaux. Les répétitions étaient stables durant les passages dans le lait, le bouillon nutritionnel et lors de l'invasion des cellules mammaires. Le gène clfA s'est aussi révélé utile pour attribuer un groupe aux lignées hôte spécifiques et établir que la dominance d'un motif clonal dans une mastite implique une sélection organe-spécifique dans la glande mammaire. Ceci fut examiné plus avant dans les isolats de différents organes de patients humains et de mastites bovines. Nos résultats montrent une corrélation significative entre les organes étudiés et la longueur du gène clfA. Vingt sur les 23 isolats d'expectoration avaient un faible taux de copies (43-48) alors que 21 des 24 isolats de peau avaient entre 55 et 63 copies. Il est aussi important de noter que les alignements d / Nous avons ensuite standardisé clfA comme marqueur pour la mastite au cours d'une expérience comparative utilisant des méthodes références, l'électrophorèse en gel pulsé et le spa, et ainsi identifié sa distribution génotypique ainsi que ses types dominants au Canada. Nos résultats montrent que clfA présente le même indice de discrimination de 0.9 que la PFGE. Deux groupes de lignage PFGE dominants (A avec 48.3% et D avec 43.7 %) représentent les types des souches présentes dans le Canada occidental et oriental respectivement. Ceux-ci furent de plus subdivisés à l'aide de clfA en quatre sous-types. En conséquence, le typage par clfA, en plus d'être concordant avec ceux par PFGE et spa, s'est avéré utile pour établir le profil de sous-populations avec le même pouvoir discriminatoire. / Par la suite, deux isolats bien caractérisés représentant des clones majeurs spécifiques pour l'Homme et les bovins ont été utilisés afin de révéler l'expression génomique totale durant l'invasion des cellules épithéliales mammaires sous des conditions normales ou réduites en oxygène. Dans l'isolat de mastite sous condition normale en oxygène, l'expression des régulateurs MerR, sigB, VraS, YycG/YycF, araC, et tetR indiqua des fonctions d'adaptation, de fixation et de protection. Le couplage du métabolisme fermentaire avec la virulence fut mise en évidence par la présence de la protéine catabolite A (ccpA), de la voie des pentoses monophosphate, et la régulation négative du cycle de Krebs. Considéré dans leur ensemble, les réponses rapides des isolats de mastite suggèrent fortement un phénotype adapté aux cellules mammaires. La description future du grand nombre de protéines hypothétiques pourrait potentiellement révéler un réseau précis de facteurs régulateurs qui sont spécifiquement exprimés dans la glande mammaire.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.92324 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Said, Kamaleldin |
| Contributors | Xin Zhao (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Animal Science) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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