All growing cells must ensure that their genetic material is faithfully replicated and divided equally to the newly formed daughter cells. Once chromosome replication has begun the cell must assure that it does not start replication until the next cell cycle. In nearly all bacteria chromosome replication is initiated by the highly conserved DnaA protein. In Escherichia coli the activity of the initiator protein DnaA is down regulated by the regulatory inactivation of DnaA (RIDA) system. Shortly after the initiation of replication, the intrinsic ATPase activity of DnaA is stimulated by Hda, a protein with homology to the ATPase domain of DnaA. Therefore, Hda converts DnaA from its active ATP bound form to its inactive ADP bound form. The current models of chromosome replication have been developed using the model bacteria E. coli. However, DnaA proteins form other bacteria differ from DnaA in E. coli in their structures and biochemical properties. A regulatory model based solely on E. coli does not take into account the diversity found among bacteria. Another model is provided by the free-living Gram-negative bacterium Caulobacter crescentus which is found in nutrient poor aqueous environments such as fresh water lakes. Genomic analysis predicts C. crescentus encodes a protein (HdaA) with homology to Hda of E. coli. C. crescentus also makes use of novel regulatory mechanisms not found in E. coli to regulate DnaA. Unlike DnaA of E. coli the DnaA protein of C. crescentus is unstable in growing cells, rapidly degraded during stationary phase and upon nutrient starvation. I have created a strain of C. crescentus with hdaA expressed under the control of a xylose dependent promoter. I demonstrated that C. crescentus depends upon a RIDA mechanism to prevent multiple initiations of chromosome replication in the same cell cycle, as blocking hdaA expression causes an increased frequency of chromosome replication as well as a blockage of cell division. I have also uncovered an unexpected role for HdaA in the stability control of DnaA. Removing HdaA from C. crescentus stabilizes the DnaA protein in growing cells and prevents complete DnaA protein removal from stationary phase cells. My experiments have identified a new role for HdaA in DnaA proteolysis that presumably works in exponentially growing cells to aid the RIDA mechanism that restricts chromosome replication to once per cell cycle. I also demonstrate that HdaA participates in the programmed transition from exponentially growing cells to the stationary phase. C. crescentus also contains a second gene (hdaB) predicted to encode a protein with homology to the DNA binding domain of DnaA. The hdaB gene is not essential for the normal growth of C. crescentus. The fact that homologs of HdaB are found in the genomes of other alphaproteobacteria suggests that, hdaB has an evolutionary conserved role in these bacteria. Form these studies I propose that HdaA not only alters DnaA activity but also DnaA protein stability. This hypothesis further suggests that C. crescentus employs both nucleotide binding/hydrolysis, as seen in E. coli and a novel proteolytic mechanism to regulate DnaA. However, no previous studies have directly addressed the nucleotide binding and ATP hydrolysis of C. crescentus DnaA. To clarify the link between ATPase activity and protein stability I created four independent single amino acid mutations in two conserved positions of C. crescentus DnaA, DnaAR300 and DnaAR357. I showed that mutations in either position reduce DnaA ATPase activity in vitro. Further in vivo studies showed that mutations C. crescentus DnaAR357 increased chromosome replication and increased DnaA stability. These results indicate that the stability of DnaA protein is linked with its ATPase activity state. Combined with the established E. coli RIDA mechanism, my results imply a similar feedback mechanism that also ties DnaA proteolysis with C. crescentus cell cycle progression. / Toutes les cellules vivantes doivent s'assurer que leur matériel génétique soit fidèlement reproduit et divisé également parmi ses cellules filles. Chez les bactéries, le contrôle de la réplication des chromosomes se fait principalement au niveau de la fréquence de l'initiation. La réplication des chromosomes commence à un point prédéterminé sur le chromosome nommé l'origine de réplication. La fréquence d'initiation de réplication dans la bactérie Escherichia coli est contrôlée principalement par le RIDA (regulatory inactivation of DnaA). Après l'initiation de la réplication, l'activité ATPase intrinsèque de DnaA est stimulée par une protéine ayant une homologie avec DnaA (Hda). Ceci stimule la conversion de la forme DnaA-ATP active en forme DnaA-ADP inactive. La protéine responsable de l'initiation de réplication des chromosomes est conservée parmi presque toutes les bactéries. Plusieurs de leurs systèmes ont évolué pour régler l'activité de DnaA qui répond aux besoins des bactéries vivant dans des milieux diversifiés.La bactérie Caulobacter crescentus est une bactérie à Gram négative qui vit dans un environnement pauvre en aliments nutritifs. C. crescentus, peut utiliser le RIDA pour contrôler l'initiation de réplication de son chromosome, car il encode une protéine (HdaA) avec homologie à la protéine Hda d'E. coli. Elle utilise également de nouveaux mécanismes de régulation qui ne se trouvent pas chez E. coli, afin de maîtriser l'activité de DnaA. Contrairement à DnaA chez E. coli, celle de C. crescentus est instable dans les cellules en croissance. Elle se dégrade rapidement pendant la phase stationnaire et lorsqu'il y a carence en éléments nutritifs. C. crescentus contient un deuxième gène (hdaB) qui encode une protéine ayant une homologie avec le domaine de liaison de l'ADN de DnaA. Afin de déterminer le rôle de HdaA, j'ai créé une souche de C. crescentus avec hdaA exprimée sous le contrôle d'un promoteur qui dépend de la présence de xylose. Je démontre que C. crescentus dépend du mécanisme RIDA afin d'empêcher les initiations multiples de la réplication des chromosomes. Bloquer l'expression de hdaA provoque une augmentation de la fréquence d'initiation de la réplication des chromosomes et un blocage de la division cellulaire. J'ai également découvert un rôle inattendu pour HdaA en lien avec la stabilité de DnaA. En l'absence de la protéine HdaA, la protéine DnaA se stabilise dans les cellules en croissance et n'est pas dégradée en phase stationnaire. Mes expériences ont identifié un nouveau rôle pour HdaA dans la protéolyse de DnaA et que HdaA participe à la transition programmée des cellules en croissance exponentielle à la phase stationnaire.J'ai identifié un deuxième gène pour C. crescentus avec homologie à dnaA nommé hdaB. Il affiche une homologie significative avec le domaine de DnaA, responsable des contacts avec l'ADN. Le hdaB n'est pas essentiel à la croissance normale de C. crescentus car il peut être éliminé sans conséquence évidente. Malgré la conservation évidente de la séquence avec le domaine de contact de l'ADN, des expériences avec des protéines purifiées in vitro démontrent qu'elles sont incapables de détecter les contacts entre HdaB et l'ADN. Ces résultats n'indiquent pas précisément un rôle du gène hdaB. Le fait que des homologues de hdaB se trouvent dans le génome d'autres alphaprotéobactéries suggère que hdaB donne un avantage aux bactéries qui n'apparaissent pas dans des conditions de laboratoire.Pour mieux comprendre le lien entre RIDA et la dégradation de la protéine DnaA, J'ai créé quatre mutants de DnaA présentant des déficiences dans leurs activités ATPase. L'expression de ces mutants donne un phénotype similaire aux cellules manquant d'HdaA: une plus haute fréquence d'initiation de la réplication des chromosomes ainsi que la stabilisation de DnaA. Ceci indique que la stabilité de DnaA est directement liée à son état d'activité et à la progression du cycle cellulaire.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114189 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Wargachuk, Richard |
| Contributors | Gregory T Marczynski (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
Page generated in 0.0022 seconds