PCZ prophylaxis has proven highly effective in preventing invasive fungal infections, despite relatively low serum drug concentrations. However, high tissue levels of this agent have been reported in treated patients. Therefore, we hypothesized that intracellular levels of antifungal agents are an important factor in determining the success of fungal prophylaxis. To examine the effect of host cell-associated antifungals on the growth of medically important molds, we exposed lung epithelial cells to antifungal agents and removed extracellular drug prior to in vitro infection. Epithelial cells exposed to PCZ and its parent molecule itraconazole, but not other antifungals, were able to inhibit fungal growth for at least 48 hours and were protected from damage caused by infection. Cell-associated PCZ levels were 40 to 50-fold higher than extracellular levels and the drug was predominantly detected in cellular membranes. Fungistatic levels of PCZ persisted within epithelial cells for up to 48 hours. Further co-localization studies using fluorophore conjugated PCZ determined that PCZ concentrates within the endoplasmic reticulum of both host and fungal cells and persists long after drug exposure. Finally, during in vitro infection of PCZ loaded cells, there is a rapid transfer of PCZ from host membrane to fungal membranes. We propose a mechanism where PCZ transfers from host membranes to fungal membranes including the endoplasmic reticulum (ER), where it accumulates to inhibit the ER membrane bound target enzyme CYP51a. Therefore, the concentration of PCZ in mammalian host cell membranes mediates its efficacy in prophylactic regimens and likely explains the observed discrepancy between serum antifungal levels and efficacy. / La prophylaxie à l'aide de PCZ est éfficace pour prévenir les infections fongiques invasives, malgré les faibles concentrations sériques. Cependant, des fortes concentrations de PCZ sont trouvés dans les tissus des patients. Nous formulons donc l'hypothése que les concentrations intracellulaires d'antifongiques sont une facteur important pour déterminer le succès des régimes prophylactiques. Pour éxaminer l'effet des concentrations intracellulaires sur des champignons médicale, on a exposé des cellules épithéliales à des concentrations difféerents d'antifongiques pour quelques heures, et qu'on a ensuite enlevé avant d'infecter les cellules avec des spores. Les cellules exposées au PCZ ou à l'itraconazole, mais pas les autres antifongiques, étaient capables d'inhiber la croissance des fongique et prevenir le dommage cellulaires. Les concentrations intracellulaires de PCZ étaient 40 à 50 fois plus élevés que les concentrations extracellulaires, et le PCZ était concentré dans les membranes cellulaires. Des concentrations fongistatiques de PCZ ont persisté dans les cellules pour plus que 48 heures. Par ailleurs, des études de localiaation ont démontré que le PCZ se concentre dans le réticulum endoplasmique des fongi et des cellules épitheliales. Finalement, au cours de l'infection, PCZ est transferé des membranes cellulaires aux fongi, où il s'accumule pour inhiber sa cible, le CYP51a. Donc, l'éfficacité de PCZ pourrait s'éxpliquer par son accumulation dans les membranes cellulaires, expliquant ainsi la descordance entre les niveaux sérumiques et l'éfficacité contre les champignons.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114373 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Campoli, Paolo |
| Contributors | Arnold Scott Kristof (Internal/Cosupervisor2), Donald Sheppard (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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