mTOR is a serine/threonine protein kinase that controls cell growth, proliferation, and survival in response to mitogens and nutrients. When inactivated by nutrient deprivation or serum withdrawal, mTOR can also enhance stress transcriptional responses. In agreement, once inhibited, mTOR binds 'signal transducer and activator of transcription-1' (STAT1), a pro-apoptotic transcription factor, and the STAT1 kinase 'protein kinase C-delta' (PKCδ). Inactivation of mTOR enhanced STAT1 nuclear import, the induction of STAT1-dependent genes (including STAT1 per se), and apoptosis, indicating a role for mTOR activity in suppressing apoptosis transcriptional responses. However the function of PKCδ in the mTOR/STAT1 complex is unknown. After identifying a target of rapamycin signalling (TOS) motif in PKCδ, we hypothesized that mTOR suppresses STAT1-dependent apoptosis via a physical interaction with PKCδ. We expressed the TOS-mutated isoform of PKCδ (ΔTOS) in mammalian cells, and determined the effect of rapamycin on STAT1 protein levels, apoptosis, or cell viability. In HEK 293T cells, phosphorylation of STAT1 was retained upon expression of ΔTOS PKCδ, indicating preservation of PKCδ kinase activity. There was an increase in cleaved caspase-3 levels (apoptosis) in cells expressing ΔTOS, as compared to wild-type (WT), PKCδ. Rapamycin failed to increase STAT1 levels in ΔTOS-expressing cells exposed to the pro-apoptotic cytokine interferon-β. In human fibrosarcoma (2fTGH) cells, the increase in cleaved caspase-3 levels by rapamycin was lost upon expression of the ΔTOS mutant. In similar, but STAT1-deficient (U3A) cells, WT or ΔTOS PKCδ failed to restore cleavage of caspase-3. Unlike apoptosis, ΔTOS PKCδ reduced viability in U3A cells, but not in 2fTGH cells exposed to rapamycin, indicating that mTOR, PKCδ, and STAT1 can control cell viability by caspase-3-independent mechanisms. Our results are consistent with an inhibitory effect of mTOR on STAT1 expression and apoptosis that is mediated by the PKCδ TOS motif. / mTOR est une sérine / thréonine protéine kinase qui contrôle la croissance cellulaire, la prolifération et la survie en réponse à des mitogènes et nutriments. Quand inactivée par une carence en nutriments ou un retrait de sérum, la protéine mTOR peut également augmenter les réponses transcriptionnelles dues au stress. En accord, une fois inhibée, mTOR se lie au 'transducteur de signal et activateur de transcription-1' (STAT1), un facteur de transcription pro-apoptotique, et une kinase pour STAT1 'protéine kinase C-delta' (PKCδ). L'inactivation de mTOR augmente l'importation nucléaire de STAT1, l'induction de gènes dépendants de STAT1 (y compris STAT1), et l'apoptose, ce qui indique un rôle de la protéine mTOR dans la suppression transcriptionnelle de réponses apoptotiques. Cependant, la fonction de PKCδ dans le complexe mTOR/STAT1 est inconnue. Après avoir identifié un motif de cible de rapamycine dans PKCδ (motif TOS), nous avons émis l'hypothèse que mTOR supprime l'apoptose dépendante de STAT1 par une interaction physique avec PKCδ. Nous avons exprimé l'isoforme TOS-mutée de PKCδ (ΔTOS) dans les cellules, et nous avons déterminé l'effet de la rapamycine sur la teneur en protéines STAT1, l'apoptose, ou la viabilité des cellules. Dans des cellules HEK 293T, la phosphorylation de STAT1 a été retenu lors de l'expression de ΔTOS PKCδ, indiquant la préservation de l'activité kinase PKCδ. Il y avait une augmentation des niveaux de caspase-3 clivés (apoptose) dans les cellules exprimant ΔTOS par rapport à PKCδ de type sauvage (WT). La rapamycine n'a pas pu augmenter les niveaux de STAT1 dans les cellules exprimant ΔTOS exposées à la cytokine pro-apoptotique interféron-. Dans les cellules humaines de fibrosarcome (2fTGH), l'augmentation des niveaux de caspase-3 clivé induite par la rapamycine a été perdue lors de l'expression du mutant ΔTOS. De façon similaire dans les cellules déficientes en STAT1 (U3A), le PKCδ WT ou ΔTOS n'a pas réussi à restaurer les niveaux de caspase-3 clivé. Contrairement à l'apoptose, les ΔTOS réduisent la viabilité des cellules dans U3A, mais pas dans les cellules exposées à 2fTGH rapamycine, ce qui suggère que la protéine mTOR, PKCδ, et STAT1 contrôlent la viabilité des cellules par des mécanismes autres que l'apoptose. Nos résultats suggèrent que le motif TOS dans PKCδ assure un effet inhibiteur de mTOR sur l'expression STAT1 et l'apoptose.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.116936 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Baig, Ayesha |
| Contributors | Arnold Scott Kristof (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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