The cell envelope of Gram-negative bacteria such as Escherichia coli is composed of an outer (OM) and cytoplasmic membrane (CM), which enclose a space known as the periplasm. For acquisition of essential nutrients, bacteria must transport molecules across both membranes. The import of certain scarce nutrients, such as iron and vitamin B12, requires the input of energy; however, the OM is devoid of any source of energy. To drive the transport of scarce nutrients across the OM, bacteria use the proton motive force of the CM. The TonBExbBExbD protein complex located within the CM is responsible for harnessing the energy of this proton gradient and transducing it to OM receptors. While the existence and the role of this complex has been investigated many years ago by genetic means and by in vivo crosslinking experiments, structural and functional aspects remain largely unknown. To date, only partial structures of periplasmic domains of TonB and ExbD are known. Additionally, information on the structure of the complex as well as stoichiometry has not been deduced. We have therefore designed a strategy for the co-expression and co-purification of ExbB and ExbD in complex. Here we produced milligram amounts of pure ExbBExbD; size-exclusion chromatography revealed that our samples were homogenous and monodisperse. Observation of our samples by negative-staining electron microscopy revealed uniform particles from which 2D reconstructions were generated. These reconstructions suggested a pentameric and perhaps cylindrical arrangement for the complex. In parallel, crystallization trials have identified promising leads. Our optimization efforts have led to the successful detergent exchange of the protein complex from dodecyl maltoside to decyl maltoside, to GNG-12 and to MNG-28; the latter two amphiphiles are proprietary and of undisclosed structure. We also adopted an NMR detergent quantitation method to standardize amounts of detergent in samples bound for crystalliz / L'enveloppe cellulaire des bactéries à Gram négatif tel Escherichia coli est constituée d'une membrane externe (ME) et d'une membrane cytoplasmique (MC), entre lesquelles se trouve un espace nommé périplasme. L'acquisition de nutriments essentiels par les bactéries nécessite le transport de molécules à travers chacune des deux membranes. Le transport de certains nutriments rares, tel le fer et la vitamine B12, requiert un apport en énergie. Cependant, la ME est dénuée de toute source d'énergie. Ainsi, pour alimenter en énergie le transport de nutriments rares à la ME, les bactéries font appel à la force proton motrice de la MC. Le complexe protéique TonBExbBExbD, situé à la MC, arnache l'énergie de ce gradient de protons et la transduit aux récepteurs de la ME. Bien que l'existence et le rôle de ce complexe aient été sondés il y a plusieurs années par des voies génétiques et des expériences de réticulation in vivo, plusieurs aspects de la structure et de la fonction du complexe restent inconnus. Jusqu'à maintenant, seule la structure des domaines périplasmiques de TonB et ExbD sont connus. Qui plus est, le structure du complexe et sa stoechiometrie n'ont pas été résolus. Nous avons donc élaborée une stratégie pour la co-expression et la co-purification d'ExbB et d'ExbD en complexe. Nous produisons plusieurs milligrammes d'ExbBExbD pur et la chromatographie par filtration sur gel révèle que nos échantillons sont homogènes et monodispersés. L'observation de nos échantillons par microscopie électronique en coloration négative révèle des particules de taille uniformes à partir desquelles des reconstructions 2D ont été générées. Ces reconstructions semblent suggérer un arrangement pentamérique et peut-être cylindrique. En outre, nos essais de cristallisation nous ont permis d'identifier des pistes prometteuses. Nos efforts d'optimisation nous ont amenés à échanger avec succès notre protéine depuis l
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.95207 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Biot-Pelletier, Damien |
| Contributors | James W Coulton (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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