In most mammalian species, all oogonia cease mitotic proliferation and enter meiosis in fetal ovaries. Furthermore, more than half of the maximum number of germ cells is eliminated from ovaries by neonatal life, thus limiting the oocyte reserve for reproduction. The cause or mechanism of this female germ cell loss remains largely unknown. A major loss occurs in the oocytes which reach the pachytene stage of meiotic prophase, suggesting that oocytes with meiotic or recombination errors may be eliminated by a checkpoint mechanism. It remains to be determined whether oocytes are eliminated by apoptosis and if so in which pathway. The purpose of my study is to investigate a mechanism of oocyte loss in the mouse ovary during meiotic prophase. We used an Msh5 null mutant mouse strain, in which all oocytes are eliminated by neonatal life. Msh5 encodes a protein required for meiotic chromosome synapsis. / Msh5 heterozygous mutant mice were crossed and ovaries were isolated from female progeny at 14.5 22.5 days postcoitum (dpc). We studied the loss of germ cells in Msh5 -/- (MT) females comparing to the Msh5 +/+ (WT) and Msh5 (+/-) (HT) females by immunolabeling of ovarian sections for GCNA1 or MVH (both germ cell markers) or by counting GCNA1 positive germ cells in cell suspension preparations. Our results showed a continuous loss of GCNA1 positive cells in both MT and WT although the loss in MT was constantly larger than in the WT. A significant difference between WT and MT was found at 19.5 dpc. / Meiotic progression was studied by GCNA1 and SC (synaptonemal complex) or SC and ɣH2AX double immunolabeling of chromosome spread preparations. We found that meiosis in MT was blocked at zygotene-pachytene transition. No normal pachytene was observed in MT. / The role of apoptosis in elimination of oocytes during meiotic prophase was investigated by analyzing the cleavage of various caspases (caspase 2, 3, 6, 7, 9) as well as PARP1 by western blot using the lysate of whole ovaries. The activation of initiator caspase 9 increased from 17.5 to 18.5 dpc and decreased by 19.5 dpc. Caspase 2L activation also increased in a similar pattern but at much lower levels. The activation of effector caspase 3 or 6 remained at low levels. The activation of caspase 7 also was low but increased slightly at 19.5 dpc. The cleavage of PARP1 was high at all investigated stages. There were not major differences in the average level of activation between WT and MT. By immunolabeling of ovarian sections we observed that cleaved caspases and PARP1 were localized in oocytes but also in cells negative for GCNA1. / These results suggest that a mitochondrial pathway of apoptosis may play a role in the elimination of oocytes during meiotic prophase, involving activation of caspase 9 and cleavage of PARP1. However further studies are necessary for identification of an effector caspase. / Dans la plupart des espèces de mammifères, tous les oocytes cessent la prolifération mitotique et initialisent la méiose dans les ovaires ftales. En outre, plus de la moitié du nombre maximal de cellules germinales est éliminée dans les ovaires pendant la vie néonatale, limitant ainsi la réserve d'oocytes pour la reproduction. La cause ou le mécanisme de cette perte de cellules germinales femelles reste largement inconnu. Une perte majeure se produit dans les oocytes qui atteignent le stade pachytène de la prophase méiotique, suggérant que les oocytes avec des erreurs dans la méiose ou des erreurs de recombinaison peuvent être éliminés par un mécanisme de contrôle. Il reste à déterminer si les oocytes sont éliminés par apoptose, et si oui, par quel méchanisme. Le but de mon projet est d'étudier un mécanisme de perte d'oocytes dans les ovaires de souris durant la prophase méiotique. Nous avons utilisé une souche de souris mutantes pour la gene Msh5, dans lequelles tous les oocytes sont éliminés durant la vie néonatale. Msh5 code pour une protéine nécessaire à la synapse de chromosomes méiotiques. / Des souris hétérozygote Msh5 ont été croisées et les ovaires ont été isolées de la progéniture féminine de 14,5 à 22,5 dpc. Nous avons étudié la perte de cellules germinales dans les ovaires des femelles Msh5 -/- (MT) en les comparant à ceux des femelles Msh5 +/+ (WT) et Msh5 +/- (HT) par immunodétection en utilisant des anticorps anti-GCNA1 et anti-MVH (marqueurs des cellules germinales) ou par le comptage des cellules positives au GCNA1 dans des suspensions cellulaires. Nos résultats montrent une perte continue de cellules positives au GCNA1 chez les souris MT et WT, bien que la perte chez les MT a été constamment supérieure à celle des WT (différence significative à 19.5 dpc). / La progression de la méiose a été étudiée par immunodétection double pour GCNA1 et SC (complexe synaptonémal) ou pour SC et γH2AX sur des préparations de chromosomes. Nous avons constaté que la méiose chez les souris MT est bloquée dans le stage de transition zygotène-pachytène. Nous n'avons pas observé de pachytène normal chez les souris MT. / Le rôle de l'apoptose dans l'élimination d'oocytes au cours de la prophase méiotique a été étudié par analyse du clivage de diverses caspases (caspases 2, 3, 6, 7, 9) ainsi que celui de la PARP1 par immunobuvardage des protéines d'ovaires entières lysées. L'activation de la caspase 9 initiatrice a augmenté entre 17.5dpc et 18.5 dpc et a ensuite baissé à 19.5 dpc. Celle de la caspase 2L a augmenté d'une manière semblable, mais à des niveaux beaucoup plus bas. L'activation des caspases effectrice 3 et 6 est demeurée à des niveaux faibles mais celle de la caspase 7 bien que faible a augmenté légèrement à 19.5 dpc. Le clivage de PARP1 était élevé dans tous les stages. Dans tous ces cas, il n'y a pas eu de grandes différences dans le niveau moyen d'activation entre WT et MT. Par immunodétection de sections d'ovaires, nous avons observé que les caspases et PARP1 clivées étaient localisées dans des oocytes, mais aussi dans les cellules sans marquage pour GCNA1. / Ces résultats indiquent que la voie mitochondriale de l'apoptose peut jouer un rôle dans l'élimination d'oocytes au cours de la prophase méiotique, puisque les clivages de la caspase 9 et de PARP1 y sont associés. Cependant des études supplémentaires sont nécessaires pour l'identification de caspases effectrices.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.92367 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Ene, Adriana |
| Contributors | Teruko Taketo-Hosotani (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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