The conjugation of ubiquitin to proteins is catalyzed sequentially by a cascade of members of three classes of enzymes – ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin conjugating enzyme (E2), and ubiquitin protein ligase (E3). Polyubiquitinated protein substrates are selectively targeted for degradation by the proteasome. Removal of ubiquitin from ubiquitinated substrates is catalyzed by deubiquitinating enzymes (DUB). In this thesis, I have explored functions of three specific enzymes of the ubiquitin system, the E2 UBC4-testis, the HECT E3 EDD/Rat100 and the deubiquitinating enzyme USP19, in mammalian spermatogenesis or muscle wasting. UBC4-testis is a rodent testis specific E2 enzyme that is induced in round spermtids. Mice lacking the UBC4-testis gene had a delay in postnatal development during the first wave of spermatogenesis but ultimately had in adulthood normal fertility and testis weights, spermatid number, protein content, rate of ubiquitination and quantity and quality of sperm. When subjected to the heat stress of experimental cryptorchidism, the profile of germ cell degeneration was not significantly different from that of wild type mice. Our data suggest that UBC4-testis has a specific function in promoting the evolution of the first wave of spermatogenesis; however, some coexisting isoforms of UBC4 may serve redundant complementary functions in later stages of spermatogensis. EDD/Rat100 is a UBC4 dependent E3 that is highly expressed in rat testis. The poly(A)-binding protein (PABP) is a translation initiation factor that is negative regulated by the PABP-interacting protein 2 (Paip2). Both PABP and EDD/Rat100 share a PABC domain, through which they can interact with Paip2. EDD/Rat100 can ubiquitinate Paip2 in vitro. Under normal in vivo conditions, the abundant PABP may sequester Paip2 from ubiquitination by EDD/Rat100. In PABP-depleted cells, Paip2 is free to interact with EDD/Rat100, which leads to Paip2 ubiquitination and degradation by the proteasome. Degradation of Paip2 may then restore the activity of PABP and therefore maintain its homeostasis. Thus, the turnover of Paip2 in the cell is mediated by EDD/Rat100 but is regulated by PABP. In addition, six proteins that were copurified from immunoprecipitation of EDD/Rat100 in rat testis have been elaborately studied, but none of them was identified as a bona fide substrate of EDD/Rat100. Finally, I studied USP19, a 150 kDa DUB that is induced in atrophying skeletal muscle. A modest increase of expression of USP19 was observed in early differentiation of L6 cells. TNF-α can increase expression of USP19 in L6 myotubes. SiRNA mediated silencing of USP19 expression can increase expression of MHC in L6 myotubes in a myogenin dependent manner. And silencing of USP19 can partially reverse the TNF-α or DEX stimulated catabolism of MHC. Thus, USP19 can regulate synthesis of myofibrillar proteins through modulating transcriptional factor in myotubes. These data demonstrate that the ubiquitin system not only mediates the increased protein breakdown but is also involved in the decreased protein synthesis in atrophying skeletal muscle. / L'attachement de l'ubiquitine à un substrat protéique est catalysé par une série de réactions en chaîne impliquant trois classes d'enzymes- l'enzyme d'activation de l'ubiquitine (E1), l'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine (E2) et l'enzyme de ligation de l'ubiquitine (E3). Les substrats protéiques polyubiquitinés sont spécifiquement reconnus par le protéasome pour être dégradés. L'enlèvement de l'ubiquitine présent sur les substrats ubiquitinés est catalysé par les enzymes de déubiquitination (DUB). Dans cette thèse, j'ai étudié les fonctions de trois enzymes du système ubiquitine : l'enzyme E2 UBC4-testis, l'enzyme E3 EDD/Rat100 et l'enzyme de déubiquitination USP19. Leurs rôles dans la spermatogénèse et l'atrophie musculaire ont été étudiés chez les mammifères.UBC4-testis est une enzyme spécifiquement exprimée dans les testicules de rongeurs et est induite dans les spermatides ronds. Des souris ayant le gène UBC4-testis inactivé démontrent un délai dans le développement postnatal durant la première vague de spermatogénèse. Par contre, arrivées à l'âge adulte, ces mêmes souris démontrent une fertilité et un poids testiculaire normal. Aussi, nous avons observé des données normales pour le nombre de spermatides, le contenu protéique, le taux d'ubiquitination ainsi que pour la quantité et la qualité des spermatozoïdes. Lorsque les testicules de ces souris sont soumis à un stress de température en effectuant une cryptorchidie expérimentale, le profil de dégénérescence des cellules germinales n'était pas significativement différent de celui de souris normales ayant subit le même traitement. Nos résultats suggèrent donc que UBC4-testis exerce un rôle dans l'évolution de la première vague de la spermatogénèse mais il est possible que d'autres isoformes UBC4 puissent exercer des fonctions redondantes dans les étapes tardives de la spermatogénèse.EDD/Rat100 est une enzyme E3 qui est dépendante de l'enzyme E2 UBC4 et qui est fortement exprimée dans les testicules de rat. La protéine de liaison au Poly(A) (PABP) est un facteur d'initiation à la traduction qui est négativement régulé par une protéine interagissant avec PABP appelée Paip2. PABP et EDD/Rat100 ont en commun un domaine appelé PABC qui peut interagir avec Paip2. EDD/Rat100 est capable d'ubiquitiner Paip2 in vitro. Dans des conditions normales in vivo, PABP, qui est en abondance, pourrait séquestrer Paip2 pour être ubiquitiné par EDD/Rat100. Dans des cellules qui ont des niveaux de PABP réduits, Paip2 est libre d'interagir avec EDD/Rat100 et est donc ubiquitiné et dégradé par le protéasome. La dégradation de Paip2 peut finalement rétablir l'activité de PABP et par conséquent maintenir son homéostasie. Ainsi, le taux de renouvellement de Paip2 dans la cellule est géré par EDD/Rat100 mais est régulé par PABP. De plus, six protéines copurifiées par immunoprécipitation avec EDD/Rat100 dans des extraits de testicules de rat ont été minutieusement étudiées mais aucune d'entre elle n'a été identifiée comme étant un substrat bona fide de EDD/Rat100.Finalement, j'ai analysé USP19, une enzyme de déubiquitination qui est induite dans les muscles squelettiques dans des conditions d'atrophie musculaire. Une modeste augmentation de l'expression de USP19 a été observée dans des cellules L6 en début de différentiation. TNF- peut augmenter l'expression de USP19 dans les cellules L6. Lorsque les niveaux d'USP19 sont réduits par ARN interférent dans les myotubes L6, l'expression de MHC est augmentée de façon dépendante de la myogénine. Aussi, en diminuant les niveaux d'USP19, la dégradation de MHC stimulée par TNF- ou par DEX peut partiellement être renversée. Donc, USP19 peut réguler la synthèse de protéines myofibrillaires en modulant la transcription dans des cellules musculaires L6. Ces résultats démontrent que le système ubiquitine n'agit non seulement sur la dégradation protéique dans les muscles squelettiques atrophiés mais aussi en diminuant la synthèse protéique.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.96699 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Pang, Zhiyu |
| Contributors | Simon Sipen Wing (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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