Glioblastoma multiforme is the most lethal primary brain tumor with a mean patient survival of 12 - 15 months. Efforts to treat glioblastoma with chemotherapeutics or radiation therapy have been largely ineffective, which is why the current treatment paradigm is predominantly based on surgery. Herein, it has been shown that the extent of surgical resection is correlated with patient outcome, i.e. less residual cancer cells result in a prolonged time to recurrence. In glioblastoma patients, magnetic resonance imaging (MRI) is used in diagnosis, MRI-guided surgery, and monitoring of disease progression. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONPs) are currently receiving increased attention as MRI contrast agents for brain imaging. Their reported proton relaxation properties, biocompatibility, and retention times are superior to the commonly employed gadolinium-based contrast agents. In addition, their larger surface area allows for the conjugation of targeting moieties and/or labels used for multi-modal imaging (e.g. fluorophores, radioisotopes). One of the most frequent genetic alterations in primary glioblastoma involves the epidermal growth factor receptor (EGFR). EGFR over-expression due to gene amplification is observed in 50 - 71% of the patients and among these the simultaneous expression of EGFR mutants is frequently seen. The most common mutation is the deletion of exon 2 – 7 of the extracellular domain, which results in ligand-independent, constitutive activation of the intracellular kinase domain. This mutant is named EGFRvIII and has been intensely investigated as potential therapeutic target, since it is considered a tumor-specific antigen, The objective of this project is to develop EGFR-targeted IONPs to improve the delineation of tumor outlines through targeted delivery of this MRI contrast agent to tumor cells. In addition, dual-labeling of the nanoplatform with near infrared fluorescent probes is expected to permit intra-operative optical imaging of infiltrative tumor cells, thereby decreasing the number of residual cancer cells left after surgical resection. To date antibodies have been the most successful targeting ligands and several immunoconjugates are already approved for molecular imaging in humans. However, small overall size (<100 nm) of the nanoparticle is crucial for achieving extended blood circulation times and high tumor penetration. Therefore, the use of smaller antibody fragments instead of the entire immunoglobulin molecule is preferred. In this study, I characterized novel anti-EGFR single domain antibodies (sdAbs) for their application as targeting moieties for nanoparticulate contrast agents. I determined the specificity and binding kinetics of these sdAbs for their targets EGFR and EGFRvIII using surface plasmon resonance (SPR) biosensor analysis and cell-based assays. I then conjugated the sdAbs to the surface of commercial IONPs and, after thorough investigation of the physical properties, I tested the tumor-targeting ability of these immuno-IONPs in a glioblastoma xenograft model. My findings are in agreement with published observations on the in vivo distribution of targeted superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Modern SPR biosensors also allow the assessment of not only the binding affinity and kinetics, but also the thermodynamic parameters of protein-protein interactions. I therefore extended the use of this technology to study the interaction of a selected anti-EGFR sdAb with the extracellular domain of EGFR (EGFR-ECD), and compared this to binding of its natural ligand, the epidermal growth factor (EGF). I demonstrate that distinct thermodynamic driving forces govern sdAb and ligand binding to EGFR-ECD. My findings complement the available structural information and provide new insight into potential mechanisms of EGF-mediated receptor activation. / Le glioblastome multiforme est la tumeur primaire du cerveau la plus mortelle avec un taux de survie moyen des patients de 12 – 15 mois. Les efforts pour traiter le glioblastome avec de la radiothérapie ou des agents chimiothérapeutiques ont été largement inefficaces, ce qui explique pourquoi le paradigme de traitement actuel est avant tout basé sur la chirurgie. Ici, il a été démontré que l'étendue de la résection chirurgicale est corrélée avec le pronostic des patients. Chez les patients de glioblastome, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est utilisée dans le diagnostic, durant la chirurgie guidée par IRM, et pour le suivi de la progression de la maladie. Les nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (IONPs) reçoivent actuellement une attention accrue comme agents de contraste en IRM pour l'imagerie cérébrale. Leurs propriétés de relaxation des protons, leur biocompatibilité et leur temps de rétention sont supérieurs aux agents de contraste à base de gadolinium couramment employée. En outre, leur surface plus grande permet la conjugaison des agents de ciblage et/ou étiquettes utilisées pour l'imagerie multimodale. Une des altérations génétiques les plus fréquentes dans le glioblastome primaire implique le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), sa surexpression est observée dans 50 – 71% des patients et parmi ceux-ci l'expression simultanée de mutants EGFR est fréquemment observé. La mutation la plus fréquente est la délétion de l'exon 2 – 7 de domaine extracellulaire, ce qui rend le EGFR insensible au ligand, et mène à l'activation constitutive de la kinase intracellulaire. Ce mutant est connu sous le nom EGFRvIII. L'objectif de ce projet est de développer des IONPs spécifiques pour l'EGFR afin d'améliorer la délimitation des contours de la tumeur grâce à l'administration d'agents de contraste IRM ciblée vers les cellules tumorales. En outre, le double-étiquetage de cette nanoplateforme avec des sondes fluorescentes proche infrarouge permettra l'imagerie optique intraopératoire des cellules tumorales infiltrantes aidant à une résection chirurgicale plus précise et ainsi diminuant le nombre de cellules cancéreuses résiduelles après l'opération. La petite taille globale (<100 nm) de la nanoparticule permet d'atteindre une circulation sanguine prolongée et une pénétration tumorale élevée. Dans cette étude, j'ai caractérisé des fragments d'anticorps contre l'EGFR pour leur application comme unité de ciblage et pouvant potentiellement servir comme agents de contraste nanoparticulaire. J'ai déterminé par résonance plasmonique de surface (SPR) et dans des tests cellulaires la spécificité et la cinétique de liaison de ces anticorps à domaine unique pour leurs cibles EGFR ainsi que pour le mutant EGFRvIII. J'ai ensuite conjugué ces anticorps à domaine unique sur la surface de IONPs commerciales et, après analyse approfondie de leurs propriétés physiques, j'ai testé la capacité de ciblage tumoral de ces immuno-IONPs dans un modèle de xénogreffe de glioblastome. Mes conclusions sont en accord avec les observations publiées sur la distribution in vivo des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer ciblés. Les biocapteurs SPR modernes permettent également la détermination des paramètres thermodynamiques pour les interactions protéine-protéine. J'ai donc utilisé cette technologie pour étudier l'interaction d'un anticorps à domaine unique contre l'EGFR avec le domaine extracellulaire de l'EGFR (EGFR-ECD) en comparaison à la liaison avec son ligand naturel, le facteur de croissance épidermique (EGF). J'ai démontré que des forces motrices thermodynamiques distinctes conduisent l'interaction d'EGFR-ECD avec l'anticorps en comparaison d'avec le ligand. Mes conclusions sont en accord avec les informations structurelles disponibles et fournissent un nouvel éclairage sur les mécanismes potentiels de l'activation du récepteur par l'EGF.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.107747 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Trojahn, Ulrike |
| Contributors | Arnim Pause (Supervisor2), Maureen D O'Connor-McCourt (Supervisor1) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
Page generated in 0.0102 seconds