The packaging of eukaryotic genomes into chromatin poses a barrier to mRNA transcription by RNA polymerase II (RNAPII). Covalent modifications of histones, the major protein components of chromatin, are key mechanisms by which all eukaryotic organisms modulate chromatin structure to allow gene expression to occur. Enzymes which catalyze some of these modifications are currently under investigation as drug targets in a variety of human cancers. Thus, a fundamental understanding of how histone modifications are targeted to chromatin and how they impact transcription is of significant importance to the treatment of cancer. Mono-ubiquitination of histone H2B (H2Bub1) is universally associated with the elongation phase of RNAPII. Elongation control is critical for the proper regulation of mammalian genes. Accordingly, depletion of the H2B ubiquitination enzyme RNF20 in cell lines causes aberrant cell migration and a defective apoptotic response to DNA damage. Establishment of H2Bub1 on chromatin requires two highly conserved transcription elongation factors: the Polymerase Associated Factor (PAF) complex and Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). PAF is a five-subunit complex that interacts directly with RNAPII, and P-TEFb consists of the kinase Cdk9 in complex with cyclin T. While it is currently known that both P-TEFb activity and the PAF complex are needed to form H2Bub1 on chromatin, the precise mechanisms through which these factors regulate H2Bub1 and RNAPII elongation are not understood.Here I have characterized the P-TEFb-PAF-H2Bub1 regulatory axis in the model eukaryote Schizosaccharomyces pombe. Analyses of PAF mutant strains suggested multiple functional modules within the PAF complex, consisting of the Paf1 and Leo1 subunits, the Tpr1 (Ctr9 in humans) and Cdc73 subunits, and the Rtf1 subunit. Tandem affinity purification of PAF revealed that Rtf1 does not stably associate with the rest of the complex, confirming its functional independence. Although they are recruited as separate units, ChIP indicated that both Rtf1 and the remaining PAF subunits require Cdk9 activity for their association with chromatin. We further examined the role of Cdk9 activity in recruitment of Rtf1, a key regulator of transcription-associated histone modifications. Importantly, a phosphomimetic substitution to the Cdk9 phosphorylation site within the Spt5 CTD resulted in Cdk9-independent Rtf1 association, arguing that Spt5 phosphorylation may be sufficient for Rtf1 recruitment.In conclusion, my analyses uncovered a complex regulatory divide in both the function and recruitment of the PAF proteins, and suggest that P-TEFb-directed activity of PAF involves multiple P-TEFb targets dedicated to different aspects of PAF complex function in S. pombe. / Chez les eucaryotes, l'assemblage du génome en chromatine influence la transcription de l'ARN messager effectuée par l'ARN polymerase II (ARNpolII). Les modifications covalentes des histones, composantes protéiques principales de la chromatine, sont des mécanismes clés qui permettent à chaque organisme eucaryote de modifier la structure de la chromatine afin de permettre l'expression génétique. Les enzymes qui permettent certaines de ces modifications sont présentement évaluées pour être utilisées comme cibles dans une grande variété de cancers humains. Il est donc très important de comprendre ces modifications de la chromatine et leurs impacts sur la transcription pour ainsi traiter les cancers efficacement. L'ubiquitination de l'histone H2B (H2Bub1) est connue pour être associée à la phase d'élongation de l'ARNpolII dont le contrôle est critique pour la régulation génétique chez les mammifères. L'absence de l'enzyme RNF20 responsable de l'ubiquitination de H2B dans les cellules entraîne une migration cellulaire aberrante et une réponse apoptotique déficiente suite à un bris dans la structure de l'ADN. Deux facteurs de transcription hautement conservés sont requis lors de l'ubiquitination de H2B sur la chromatine soit le complexe du facteur associé à la polymérase (PAF) et le facteur d'élongation transcriptionnel positif b (P-TEFb). PAF est un complexe de cinq sous-unités qui interagit directement avec ARNpolII et P-TEFb est la kinase Cdk9 qui est liée à la cycline T. Actuellement, il est connu que le complexe PAF et l'activité de P-TEFb sont requis pour permettre la formation de H2Bub1 sur la chromatine par contre les mécanismes précis par lequels ces facteurs affectent la régulation H2Bub1 et l'élongation de l'ARNpolII demeurent méconnus.La présente étude a permis de caractériser la régulation P-TEFb-PAF-H2Bub1 dans le modèle eucaryotique Schizosaccharomyces pombe. L'analyse de différentes souches possédant des mutations du complexe PAF suggèrent la présence de fonctions spécifiques reliées aux différentes sous-unités soit Paf1 et Leo1, Tpr1 (Ctr9 chez l'être humain) et Cdc73, et finalement Rtf1. Nous avons démontré par la méthode de purification d'affinité en tandem (TAP) de PAF que Rtf1 ne s'associe pas de manière stable avec les autres sous-unités du complexe supportant ainsi l'idée de son indépendance fonctionnelle. Malgré le fait que les sous-unités sont recrutées de manière indépendante, l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) démontre que Rtf1 et les autres sous-unités nécessitent l'activité de Cdk9 pour permettre leur association à la chromatine. Nos recherches nous ont menées à étudier le rôle de l'activité de Cdk9 lié au recrutement de Rtf1 qui est un régulateur clé dans les modifications d'histones associées à la transcription. Une mutation phosphomimétique du site de phosphorylation de Cdk9 dans le domaine C-terminal (CTD) de Spt5 démontre que l'association de Rtf1 est indépendante de Cdk9, ce qui supporte l'hypothèse que la phosphorylation de Spt5 est suffisante pour recruter Rtf1.En conclusion, mes analyses ont permis de découvrir que la régulation du complexe est divisée selon la fonction et le recrutement des protéines PAF, et suggèrent que l'activité de P-TEFb implique diverses cibles qui affectent différents aspects de la fonction du complexe PAF chez S. pombe.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114598 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Nagy, Stephen |
| Contributors | Jason Tanny (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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