The ErbB2 and TGFβ signaling pathways cooperate to promote breast cancer progression and metastasis. The formation of distant metastases is the leading cause of mortality for breast cancer patients. To identify the mechanisms underlying the synergy between ErbB2 and TGFβ pathways, we transformed mammary epithelial cells with a panel of activated ErbB2 receptors, in which specific autophosphorylation sites that initiate distinct signaling pathways were mutated. We determined tyrosine residues 1226/1227 and 1253 within the ErbB2 receptor are required for TGFβ-induced migration and invasion of breast cancer cells. Using transient knockdown approaches, we subsequently demonstrated that ShcA was required downstream of these tyrosine residues for these TGFβ-mediated effects. In addition, TGFβ stimulation of ErbB2-expressing breast cancer cells with diminished ShcA expression resulted in the formation of larger and more numerous focal adhesions. These results indicated that signaling through ShcA is required for the TGFβ-induced formation of pro-migratory, dynamic focal adhesions in ErbB2-expressing cells. To investigate a requirement for ShcA signaling in the promotion of tumor progression and metastasis in vivo, we generated ErbB2-expressing breast cancer cells with a stable shRNA-mediated knockdown of ShcA expression. Diminished ShcA expression impaired tumor growth and spontaneous metastasis. Immunohistochemical staining revealed that loss of ShcA signaling results in decreased tumor proliferation and endothelial cell recruitment, coupled with an increase in apoptosis. Rescue experiments with wild-type ShcA or a panel of ShcA functional domain mutants revealed that the PTB-domain and three tyrosine residues (239/240 and 313) were necessary for TGFβ-induced migration and invasion. The Grb2 and Crk adaptor proteins have been implicated in signaling downstream of these ShcA tyrosine residues. A transient knockdown of these adaptors uncovered specific roles for Grb2 downstream of ShcA Y313 and the Crk adaptors downstream of ShcA Y239/240 for TGFβ-induced effects. An investigation of the significance of these ShcA tyrosine sites for tumor growth in vivo demonstrated that ShcA signaling through Y313 enhances tumor cell survival while signaling through ShcA Y239/240 promotes the recruitment of endothelial cells. Finally, we employed an inducible knockdown of ShcA to identify acute TGFβ-induced gene expression changes in ErbB2-expressing cells that depend on ShcA expression. We identified numerous candidate genes that were regulated by TGFβ in a ShcA-dependent manner, including the BMP antagonist, Chordin-like 1. We confirmed that reduced ShcA signaling results in the up-regulation of secreted Chordin-like 1 protein in ErbB2-expressing cells following TGFβ stimulation. Functional roles for Chordin-like 1 in ErbB2-driven tumor growth, survival and angiogenesis are currently being investigated.The work described in this thesis is the first to identify ShcA as an integral mediator underlying the cooperation between the ErbB2 and TGFβ signaling pathways in breast cancer progression and to define molecular mechanisms through which ShcA functions in this context. / Les voies de signalisation ErbB2 et TGFβ coopèrent pour favoriser la progression tumorale et la formation de métastases associées au cancer du sein. La formation de métastases appert comme la principale cause de mortalité chez les patientes atteintes du cancer du sein. Dans le but d'identifier les mécanismes impliquants les voies de signalisation ErbB2 and TGFβ, nous avons transformé des lignées de cellules mammaires épithéliales avec différentes versions activées du récepteur ErbB2, dans lesquelles chacun des sites individuels d'autophosphorylation sont mutés. Ainsi, nous avons identifié les tyrosines 1226/1227 et 1253 du récepteur ErbB2 comme nécessaires pour l'augmentation de la migration et de l'invasion observée dans les cellules de cancer de sein traitées avec TGFβ. Par la suite, nous avons démontré que ShcA agissait en aval de ces résidus tyrosines pour médier les effets associés au traitement par TGFβ. Par ailleurs, la stimulation par TGFβ de cellules de cancer du sein exprimant ErbB2 et dans lesquelles l'expression de ShcA était atténuée se traduisait par la formation d'adhésions focales plus larges et plus nombreuses. Ensemble, ces résultats suggèrent qu'une voie de signalisation impliquant ShcA est nécessaire pour la formation d'adhésions focales pro-migratoires en réponse au traitement par TGFβ dans les cellules exprimant ErbB2. Afin de déterminer un rôle potentiel de ShcA pour favoriser la progression tumorale et la formation de métastases in vivo, nous avons généré des lignées cellulaires de cancer du sein dans lesquelles le niveau d'expression de ShcA était diminué de façon stable. Nous avons observé que la diminution du niveau d'expression de ShcA se traduisait par une réduction de la croissance tumorale et la formation de métastases. Par marquage immunohistochimique, nous avons observé que la perte d'expression de ShcA s'accompagnait d'une réduction de la prolifération tumorale et du recrutement des cellules endothéliales associée à une augmentation de l'apoptose. Des expériences de réexpression de ShcA de type-sauvage ou de versions mutantes des différents domaines fonctionnels ont montré que le domaine PTB ainsi que 3 résidus tyrosines (239/240 et 313) étaient impliqués dans l'augmentation de la migration et de l'invasion induite par traitement par TGFβ. Les protéines adaptatrices Grb2 et Crk peuvent signaler en aval de ces trois résidus tyrosines. Une diminution du niveau d'expression de ces différentes protéines adaptatrices a révélé un rôle joué par Grb2 en aval de Y313 de ShcA ainsi qu'un rôle de Crk en aval de Y239/240 de ShcA pour favoriser les effets associés au traitement des cellules par TGFβ. Une analyse in vivo a démontré que la signalisation utilisant Y313 favorisait la survie des cellules tumorales alors que la signalisation utilisant Y239/240 favorisait le recrutement des cellules endothéliales.Finalement, en réduisant l'expression inductible de ShcA nous avons identifié des gènes dont l'expression, qui dépend de l'expression de ShcA, est modifiée en réponse au traitement par TGFβ de cellules de cancer de sein exprimant ErbB2. Ainsi, nous avons identifié plusieurs candidats dont Chordin-like 1, un antagoniste des BMP. Nous avons par la suite confirmé que la réduction d'expression de ShcA se traduisait par une augmentation de la forme secrétée de la protéine Chordin-like 1 dans des cellules exprimant ErbB2 stimulées par TGFβ. Les rôles fonctionnels joués par Chordin-like 1 dans la formation, la croissance, la survie ou l'angiogenèse associées aux tumeurs exprimants ErbB2 est actuellement sous investigation.L'ouvrage présenté dans cette thèse est le premier à identifier ShcA comme étant un médiateur «integral » de la collaboration de signalisation intracellulaire entre ErbB2 et TGF-β lors de la progression du cancer du sein et qui définie le mécanisme moléculaire par lequel ShcA entreprend ses fonctions dans cette situation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114134 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Northey, Jason Jonathan |
| Contributors | Peter Siegel (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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