Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) genomic RNA (gRNA) dimerization appears essential for viral infectivity via, among others, facilitating gRNA strand exchange during reverse transcription, but the gRNA dimerization mechanisms remain largely unknown. What is well known about gRNA dimerization is that the dimerization process requires the proteolytic processing of Pr55gag polyprotein into smaller products. If the gag processing is blocked experimentally, it will lead to the formation of low-mobility dimers which is termed immature dimers, as apposed to high-mobility dimers (mature dimers) formed in the wild type HIV-1. Two kinds of dimers have been isolated from HIV-1 particles: Immature dimers isolated from grown-up (≥ 24h old) protease-inactive (PR-in) and from newly released (0-15min old) virions; mature dimers isolated from grown-up wild type and some mutants of HIV-1. My first research project is to identify the roles of NC-containing proteins including Gag polyprotein, NCp15, NCp9, and NCp7 in HIV-1 gRNA dimerization. I showed for the first time that the formation of immature genomic RNA dimers (igRNAds) in protease-inactive (PR-in) HIV-1 is protein-dependent (Gag-dependent, not spontaneous) and the nucleocapsid (NC) portion of the Gag polyprotein chaperones the formation of igRNAds. Based on the effect of 19 mutations studied in grown-up PR-in HIV-1, I showed that the proximal zinc finger and the linker sequences but not the distal zinc finger of the nucleocapsid protein play critical roles in the formation of igRNAds in PR-in HIV-1. However, the basic nature of the basis residues of the N-terminus and the linker are not involved in igRNA dimer formation. Other maturation products of NC, i.e. NCp15, NCp9, and NCp7, have differential roles in HIV-1 gRNA dimerization. Newly released p9 HIV-1 contains much lower level of immature dimers compared to NCp15 and NCp7 HIV-1 and the rate of accumulation of immature dimers is similar to PR-in HIV-1. But, NCp9 is as efficient as NCp7 in the transformation of immature dimers to mature dimers. On the other hand, NCp15 like NCp7 directs the fast accumulation of immature dimers in newly released HIV-1. Nonetheless, NCP15 like Gag polyprotein is quite inefficient in the maturation process, i.e. the transformation of immature dimers to mature dimers. To summarize: NCp7 is efficient in fast formation of immature gRNA dimers and the maturation process; NCp15 is only efficient in the formation of fast immature dimers; NCp9 is efficient in the transformation process but not in the fast formation of immature dimers. The Dimer Initiation Site (DIS) is a dimerization initiation site for all immature gRNA dimers, irrespective of their mechanism of formation. In the second part of my thesis I studied the role of the 5' transactivation response element (TAR) in HIV-1 gRNA dimerization. By making mutations in the upper TAR stem-loop structure including two palindrome sequences, I showed that this region contributes enormously to HIV-1 gRNA dimerization. However, gRNA dimerization was not restored in the compensatory mutants of both palindromes, suggesting that TAR-TAR kissing mechanism is not involved in gRNA dimerization. By jointly mutating TAR and deleting DIS, I showed that the TAR-dependent dimerization is not associated with the DIS. For the first time I showed that the UCU bulge of TAR is very important for HIV-1 gRNA dimerization and we conclude that the role of large TAR mutations in gRNA dimerization is entirely assumed by the TAR bulge. / La dimérization de l'ARN génomique (gRNA) du Virus d'Immunodéficience Humaine 1 (VIH-1) est essentiel pour un virus infectieux parce que, entre autres, elle facilite l'échange de brins pendant la transcription inverse. On sait déjà que le processus de dimérisation requiert au moins un certain degré de maturation protéolytique de la polyprotéine Pr55gag, une protéine dont la maturation progressive génère les protéines NCp15, NCp9 et, finalement, NCp7. J'ai d'abord identifié les rôles respectifs de Pr55gag, NCp15, NCp9 et NCp7 dans la dimérisation de l'ARN génomique (ARNg). J'ai montré que la formation de dimères immatures du gRNA (igRNAds) est dépendante de Gag chez les VIH-1 avec une protéase-inactive (PR-in), et que la portion nucleocapside (NC) de Pr55gag est essentielle à cette forme de dimérisation. Me basant sur les effets de 19 mutations étudiées chez les VIH-1 PR-in adultes (vieux de 12 h et plus), j'ai montré que le doigt de zinc proximal et la séquence du linker du NC, mais non son doigt de zinc distal, jouent un rôle critique dans la formation de igRNAds chez les VIH-1 PR-in. Cependant, la nature basique des résidus du N-terminus et du linker ne contribue pas à la formation de igRNAds. Les autres produits de maturation de NC, c.-à-d. NCp15, NCp9 and NCp7, jouent des rôles différentiels dans la dimérisation de l'ARN du VIH-1. Les VIH-1 p9 fraichement sortis contiennent un très faible niveau de dimères immatures par rapport aux VIH-1 p15 et p7, et le taux d'accumulation des ces dimères ressemble à celui qui est observé chez les VIH-1 PR-in. Mais NCp9 est aussi efficace que NCp7 dans la maturation des dimères immatures. Par ailleurs, NCp15 forme des dimères immatures aussi rapidement que NCp7, mais est incapable de les transformer en dimères matures. En résumé: NCp7 est efficace à la fois en formation rapide et en maturation des dimères immatures; NCp15 est efficace uniquement en formation de dimères immatures; NCp9 est efficace en maturation, mais pas en formation de dimères immatures. Le DIS est le site d'initiation de la dimérisation de tous les dimères immatures, peu importe leur mécanisme de formation. Dans la 2ème partie de ma thèse, j'ai étudié le rôle de l'ARN TAR 5' (transactivation response element) dans la dimérisation du VIH-1. En introduisant des mutations dans le haut du TAR tige-boucle, qui contient deux séquences palindromiques, j'ai montré que cette région contribue énormément à la dimérisation de l'ARNg du VIH-1. Cependant, la dimérisation n'a pas été rétablie par des mutations compensatoires dans chacun de ces 2 palindromes, suggérant qu'un mécanisme de TAR-TAR "kissing" n'est pas significatif pendant la dimérisation de l'ARNg. En mutagénisant TAR et en supprimant le DIS, j'ai montré que les mutations dans TAR et dans le DIS avaient des rôles indépendants durant la dimérisation. Pour la première fois, j'ai montré que la boucle UGU de TAR joue un rôle très important dans la dimérisation de l'ARNg, et je conclus que le rôle de TAR dans la dimérisation de l'ARNg est entièrement assumé par la boucle du TAR.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114324 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Jalalirad, Mohammad |
| Contributors | Michael Laughrea (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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