Heat shock cognate 70 kDa protein (hsc70) is a well conserved molecular chaperone involved in many physiological functions such as the stress response, protein folding, and protein transport. Moreover, hsc70 plays roles in human disease, such as cancer, neurodegenerative disease, heart and brain ischemia, and it also takes part in the aging process. With the help of co-chaperones and ATP hydrolysis, hsc70 can restore proper protein folding by binding to normally inaccessible hydrophobic residues on its target. Following heat shock, hsc70 traffics from the cytoplasm to the nucleoplasm. Hsc70 further accumulates in nucleoli during heat stress recovery. Using GFP-tagged portions of hsc70, I identified the nucleolar localization sequence (NoLS) of hsc70. Following quantification of the fluorescence signal, I showed that the nucleolar accumulation of different constructs varied. This allowed me to identify a heat inducible segment on hsc70, residues 225 to 297, which is sufficient for nucleolar accumulation during recovery from stress. The analysis of deletion mutants generated for segment 225-297 revealed that some constructs accumulated in the nucleolus constitutively, while others did not target GFP to nucleoli. Using pharmacological inhibitors, I also showed that PI3-kinase, MEK (MAP kinase kinase) and tyrosine dephosphorylation are involved in the hsc70 nucleolar accumulation process. The nucleolus is a well defined compartment in the nucleus that is dynamic and characterized by multiple functions. Nucleoli are currently at the center of important discoveries as they play a role in diseases such as cancer. The nucleolus participates in the control of cell cycle progression and viral infections, but its fundamental function is the assembly of ribosomes. Several thousand proteins have been identified in the nucleolus; however, as the nucleolus is dynamic, this composition depends on physiological and environmental conditions. My work focused on reviewing our knowledge of the possible chaperone networks present in the nucleolus. A new set of proteins, the nucleolar multitasking proteins (NoMPs), has been identified as chaperones that are necessary for the specific function of the nucleolus. These multitasking proteins include B23 and nucleolin. This work provided the basis for us to predict interactions between chaperones in the nucleolus.Many proteins of the nucleolus are dynamic: they can traffic to other cellular compartments when environmental conditions change. To define the mechanisms of hsc70 nucleolar accumulation during stress recovery, my work aimed at identifying the nucleolar binding partners of hsc70. I provided evidence that RNA plays a role for hsc70 nucleolar accumulation by treating heat shocked cells with detergent and RNase. Furthermore, inhibition of RNA polymerase I increased the retention time of endogenous hsc70 in the nucleolus. In further studies I examined the GFP-tagged hsc70 NoLS in transfected cells. This reporter displayed increased nucleolar accumulation and delayed release from the nucleolus during the recovery from heat shock when cells were treated with actinomycin D. On the other hand, RNA polymerase I inhibition was not sufficient to accumulate hsc70 or the GFP-tagged NoLS in nucleoli under normal growth conditions. In addition to the links between nucleolar RNA and hsc70, my research demonstrated that hsc70 and its NoLS bind to polyA+ RNA under normal growth conditions.Taken together, my studies advance our current understanding of the nucleolar accumulation of hsc70 during heat stress recovery. I identified important sequence elements, pathways and possible nucleolar anchors that contribute to hsc70 nucleolar accumulation. My work congregates important concepts that will likely be beneficial to human health. / La protéine apparentée à la protéine de choc thermique 70 kDa (hsc70: heat shock cognate 70 kDa protein) est une chaperonne moléculaire impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques telles que la réponse au stress, le repliement des protéines, ainsi que dans le transport de celles-ci. Hsc70 joue des rôles dans les maladies humaines, comme le cancer, les maladies neurodégénératives, l'ischémie du cerveau et du cœur, et elle prend part au processus de vieillissement. Avec l'aide des co-chaperonnes et de l'hydrolyse de l'ATP, hsc70 peut replier correctement les protéines en se liant aux résidus hydrophobes normalement inaccessibles.Suivant un choc thermique, hsc70 se déplace du cytoplasme vers le nucléoplasme. Hsc70 s'accumule subséquemment dans les nucléoles, pendant la récupération du stress thermique. Utilisant des portions de hsc70 liées à GFP, j'ai identifié la séquence de ciblage au nucléole (NoLS: nucleolar localization sequence) de hsc70. En quantifiant le signal fluorescent, j'ai démontré que l'accumulation nucléolaire des constructions variait. J'ai ainsi identifié un fragment inductible par la chaleur sur hsc70, aux résidus 225 à 297, qui est suffisant pour l'accumulation au nucléole pendant la récupération du stress. Des délétions générées dans le segment 225-297 ont révélé que certaines constructions s'accumulaient constitutivement au nucléole, alors que d'autres ne ciblaient jamais GFP au nucléole. Utilisant des inhibiteurs pharmacologiques, j'ai également démontré que PI3-kinase, MEK (MAP kinase kinase) et la déphosphorylation des tyrosines, sont impliqués dans le processus de l'accumulation nucléolaire de hsc70.Le nucléole, compartiment bien défini du noyau, est dynamique et a de multiples fonctions. Les nucléoles sont importants car ils jouent un rôle dans les maladies telles les cancers, participent au contrôle de la progression du cycle cellulaire, et aux infections virales, mais leurs fonction fondamentale est l'assemblage des ribosomes. Plusieurs milliers de protéines ont été identifiées dans le nucléole, cependant, comme le nucléole est dynamique, cette composition dépend des conditions physiologiques et environnementales. Mon projet focalise aussi sur la revue des connaissances portant sur les possibles réseaux de chaperonnes présents dans le nucléole. Une nouvelle catégorie de protéines, les protéines multitâches (NoMP: nucleolar multitasking protein), a été identifiée comme étant des chaperonnes nécessaires pour la fonction spécifique du nucléole. Celles-ci sont B23 et la nucléoline. Ce travail nous a procuré les bases permettant de prédire les interactions entre les chaperonnes dans le nucléole.Plusieurs protéines du nucléole sont dynamiques: elles peuvent se déplacer vers d'autres compartiments cellulaires selon les conditions. Mon projet visait à identifier les partenaires qui se lient à hsc70. J'ai démontré que l'ARN joue un rôle dans l'accumulation nucléolaire de hsc70. De plus, l'inhibition de l'ARN polymérase I augmente la duré de rétention nucléolaire de la hsc70 endogène. Avec des cellules transfectées et l'actinomycine D, j'ai examiné le NoLS lié à GFP qui démontre une accumulation nucléolaire plus élevée, ainsi qu'un délai dans le relâchement du nucléole pendant la récupération du stress à la chaleur. D'autre part, l'inhibition de l'ARN polymérase I n'était pas suffisante pour accumuler hsc70, ou le NoLS liée à GFP, dans le nucléole lors de conditions normales. En plus des liens entre l'ARN nucléolaire et hsc70, ma recherche a démontré que hsc70 et son NoLS se lient à l'ARN polyA+.Mes travaux contribuent à notre compréhension de l'accumulation de hsc70 dans le nucléole lors de la récupération du stress à la chaleur. J'ai identifié d'importants éléments de séquence, des voies et des ancres nucléolaires possibles qui contribuent à l'accumulation de hsc70 au nucléole. Mes travaux regroupent d'importants concepts qui vont possiblement être bénéfiques à la santé humaine.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114326 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Banski, Piotr |
| Contributors | Ursula Stochaj (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Physiology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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