Short, repetitive G-rich DNA sequences present at telomeres are synthesized by telomerase, a ribonucleoprotein consisting of a catalytic subunit, the telomerase reverse transcriptase, TERT, and an integrally associated RNA, TR. Human TERT (hTERT) can repetitively reverse transcribe its short RNA template, acting processively to add multiple telomeric repeats onto the same DNA substrate. We investigated if threshold levels of telomerase activity and processivity are required to maintain telomere length and/or function and immortalize human cells with limited lifespan. Specifically, we assessed hTERT variants with mutations in several motifs implicated in processivity, namely the N terminus (E79A, E90K), RT motif 1 (I624M), the 'Insertion in Fingers' domain (V791Y), the C 'catalytic center' motif (L866Y), the E 'primer grip' motif (W930F) and the C terminus (∆1047-1056 and ∆1107-1118). The N-terminal and motif 1 hTERT mutants did not reveal any interesting phenotypes in vitro or in cells. On the other hand, the remaining variants, except L866Y, displayed a substantial decrease in processivity. Despite the presence of short telomeres in cells expressing these low processivity telomerase variants, only W930F could immortalize limited lifespan human cells. We demonstrate that limiting levels of DNA synthesis on the order of 20% of wild-type, and extension of as few as three telomeric repeats displayed by W930F are sufficient to maintain functional telomeres and immortalize limited lifespan human cells. The hTERT-C-terminal mutants likely could not immortalize cells due to synthesis of only 2 or less telomeric repeats. V791Y could not maintain telomere function due to a failure to localize to telomeres. On the other hand, L866Y displayed a 2-3 fold increase in proccessivity compared to wild-type telomerase. Cells expressing this mutant displayed telomere elongation followed by heterogenous telomere lengths and an increase in short telomeres, and fragile sites at telomeres accompanied by telomere trimming, indicating that processivity levels above that displayed by wild-type telomerase lead to telomere replication stress. These results suggest that telomere function and length, and immortalization in human cells are regulated by telomerase enzyme processivity. / Des courtes séquences répétées et G-riches d'ADN présentes aux télomères sont synthétisées par télomérase, une ribonucléoprotéine constituée d'une sous-unité catalytique, 'telomerase reverse transcriptase' ou 'TERT', et un ARN associé nommé 'TR'. TERT humain (hTERT) peut diriger de façon répétitive la transcription inverse de son ARN, agissant processivement en ajouteant de multiples répétitions télomériques sur le substrat d'ADN. Nous avons étudié si des niveaux limites d'activité ou de processivité de télomérase sont nécessaires pour maintenir la taille ou la fonction des télomères et pour immortaliser des cellules humaines possédant une durée de vie limitée. Plus précisément, nous avons évalué plusieurs variants de hTERT avec des mutations dans des motifs impliqués dans la processivité, incluant l'extrémité N-terminale (E79A, E90K), le motif 1 du Reverse Transcriptase (RT) (I624M), le domaine 'Insertion in Fingers' (V791Y), le motif C (L866Y), le motif E (W930F) et l'extrémité C-terminale (Δ1047-1056 et Δ1107-1118). Les mutations dans le terminus N et le motif 1 de hTERT n'ont pas révélées de phénotypes intéressants. Les autres variants, sauf L866Y, ont demontré une diminution substantielle des niveaux de processivité. Malgré la présence de télomères courts dans les cellules exprimant ces variantes de processivité faibles, seul W930F pouvait immortaliser les cellules. Nous démontrons que le niveau de synthèse d'ADN de l'ordre de 20% de hTERT sauvage, et l'extension de seulement trois répétitions télomériques par W930F sont suffisants pour maintenir des télomères fonctionnels et immortaliser les cellules. Les variants avec des mutations dans le terminus C ne pouvaient pas immortalizer les cellules dues à la synthèse de seulement 2 ou moins de répétitions télomériques. V791Y ne pouvait pas maintenir la fonction des télomères en raison d'une incapacité à se localiser aux télomères. D'autre part, L866Y a demontré une augmentation des niveaux de proccessivité de 2-3 fois par rapport à la télomérase sauvage. Les cellules exprimant ce mutant ont presenté un rallongement des télomères, suivi de télomères de tailles hétérogènes et une augmentation du nombre de télomères courts, accompagné d'une augmentation de sites fragiles aux télomères et de télomères tronqués, tout ce qui indique que des niveaux de processivité plus élevés que ceux du type sauvage mènent à des difficultés réplicatives aux télomères. Ces résultats suggèrent que la fonction et la taille des télomères, et l'immortalisation des cellules humaines sont réguléss par la processivité de l'enzyme télomérase.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.116879 |
| Date | January 2013 |
| Creators | D'Souza, Yasmin |
| Contributors | Chantal Autexier (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Anatomy and Cell Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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