Trypanosomatid pathogens cause devastating diseases in humans and animals and continue to pose a major challenge in the drug development. Mitochondrial gene expression in trypanosomatid pathogens requires extensive post transcriptional modification, known as RNA editing which generates translatable transcripts for essential components of parasite respiratory complex. RNA editing is catalyzed by a multiprotein complex called editosome. Most of the editosome proteins are essential for parasite survival, thereby making editosome a suitable target for drug discovery. However, how editosome proteins are assembled and perform RNA editing is not fully understood. We hypothesized that identification of novel compounds targeting and perturbing this unique process will not only help to determine the function and assembly of the editosome proteins but may also be used as compounds against all three major trypanosomatid pathogens. In the first part of the thesis, I present developing and testing of a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based high throughput screening assay for identification of compounds that inhibit editosome function. Furthermore, we use our assay to confirm inhibiting effect of known inhibitors of an essential editosome protein, T. brucei RNA editing ligase 1(TbREL1). Using our assay, we also show that these inhibitors are able to inhibit RNA editing in the context of partially purified editosome.The second part of thesis describes a pilot screen of a small set of compounds that were identified via virtual screening of a chemical library against TbREL1. Using secondary biochemical assays we confirmed the specificity of inhibition and showed that these compounds find other targets in addition to the intended TbREL1 target. We showed for the first time that the inhibitory compounds interfere with the interaction of editosome with substrate RNA and consequently lead to the loss of all activities associated with the functional editosome. Moreover, we show that this inhibition is able to interfere with the assembly of the editosome proteins and propose a model to describe possible mode of inhibition by these compounds. In the third part of thesis, I present a study that compares the mechanism of action of inhibitory compounds in the context of recombinant versus native TbREL1 in the editosome. We show that these compounds interfere with RNA substrate binding activities of the editosome accessory factors MRP1&MRP2 (mitochondrial RNA binding proteins 1&2) which result in perturbing other editing activities. We show that these compounds can only inhibit TbREL1 function when the accessory factors are not present. Furthermore, we performed alanine mutagenesis of the amino acid residues of TbREL1 that are predicted to bind inhibitors. We provide a detailed map of the structure of enzyme-inhibitor complex with an opportunity for future design of more potent inhibitors of TbREL1. These studies have led to identification and characterization of novel inhibitors that result in inactivation of editosome function. Moreover, elucidation of the mechanism of RNA editing inhibition provides a basis for future selection of more efficient and potent inhibitors against the editosome proteins. Therefore, this work contributes to both the functional studies of an essential gene expression mechanism and to an exciting possibility for future drug development against three related trypanosomatid pathogens. / Pathogènes des trypanosomatides sont responsable de maladies dévastatrices chez les humains et les animaux et continuent de poser un défi majeur dans le développement de médicaments. L'expression du gène mitochondrial chez les agents pathogènes de la famille des trypanosomatides nécessite une modification post transcriptionnelle vaste, connue sous le nom d'édition de l'ARN, qui génère des transcrits traduisibles pour les composants essentiels du complexe respiratoire du parasite. L'édition de l'ARN est catalysée par un complexe multiprotéique appelé éditosome, dont la plupart des protéines sont essentiels pour la survie du parasite, ce qui fait de l'éditosome une cible appropriée pour la découverte de médicaments. Cependant, la façon dont les protéines de l'éditosome sont assemblés et effectue l'édition de l'ARN n'est pas entièrement comprise. Nous émettons l'hypothèse que l'identification de nouveaux composés ciblant et perturbant ce processus unique permettra non seulement de déterminer la fonction et l'assemblage des protéines de l'éditosome mais également d'être utilisé en tant que composés contre les trois principaux pathogènes de la famille des trypanosomatides. Dans la première partie de la thèse, je présente l'élaboration et l'essai basé sur la fluorescence avec un criblage à haut débit pour l'identification de composés qui inhibent la fonction de l'éditosome. En outre, nous avons utilisé notre test pour confirmer l'effet inhibiteur des inhibiteurs connus d'une protéine essentielle de l'éditosome, T. brucei RNA editing ligase 1(TbREL1). Grâce à notre test, nous avons montré également que ces inhibiteurs sont capables d'inhiber la fonction d'édition de l'ARN dans le contexte de l'éditosome partiellement purifié. La deuxième partie de la thèse décrit un essai pilote d'un petit ensemble de composés qui ont été identifiés par criblage virtuel contre TbREL1. En utilisant des tests secondaires, nous avons confirmé la spécificité de l'inhibition et montré que ces composés ont trouvé d'autres cibles en plus de celle de TbREL1. Nous avons montré pour la première fois que les composés inhibiteurs interférent avec l'interaction de l'éditosome à l'ARN substrat et par conséquent entraîne la perte de toutes les activités liées à la fonction de l'éditosome. De plus, nous avons montré que cette inhibition est capable d'interférer avec l'assemblage des protéines de l'éditosome et avons proposé un modèle pour décrire le mécanisme possible d'inhibition par ces composés. Dans la troisième partie de la thèse, je présente une étude qui compare le mécanisme d'action des composés inhibiteurs dans le contexte de TbREL1 recombinant ou natif dans l'éditosome. Nous avons montré que ces composés interfèrent avec les activités de liaison à l'ARN des facteurs accessoires de l'éditosome MRP1 et MRP2 (protéines liant les ARN mitochondriaux 1 & 2) qui aboutissent à la perturbation d'autres activités d'édition. Nous avons montré que ces composés peuvent seulement inhiber la fonction de TbREL1 en l'absence des facteurs accessoires. En outre, nous avons effectué une mutagenèse d'alanine des résidus d'acides aminés de TbREL1 qui sont prévus dans la liaison aux inhibiteurs. Nous fournissons une carte détaillée de la structure du complexe enzyme-inhibiteur avec une opportunité de conception future de plus puissants inhibiteurs de TbREL1. Ces études ont conduit à l'identification et la caractérisation de nouveaux inhibiteurs qui se traduisent par l'inactivation de la fonction de l'éditosome. En outre, l'élucidation du mécanisme d'inhibition de l'édition de l'ARN fournit une base pour la sélection future d'inhibiteurs plus efficaces et plus puissants contre les protéines de l'éditosome. Par conséquent, ce travail contribue à la fois aux études fonctionnelles d'un mécanisme d'expression d'un gène essentiel et à une possibilité passionnante pour le développement de futur médicament contre trois agents pathogènes liés de la famille des trypanosomatides.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.117029 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Moshiri, Houtan |
| Contributors | Reza Salavati (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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