Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a cancer of the white blood cells (B cell lymphocytes). It is an indolent disorder that results in the accumulation of CD5+ B cells. In CLL, resistance to cell death is attributed to the overexpression of several key pro-survival proteins (i.e. B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) and myeloid cell leukemia- 1 (Mcl-1)) that belong to the apoptotic Bcl-2 family of proteins. Bcl-2 and Mcl-1 overexpression deregulates both the apoptotic and autophagic signaling pathways and contributes to tumorigenesis. Oncolytic virotherapy has emerged as a novel anti-cancer therapy for the treatment of a variety of malignant disorders. Oncolytic virus (OV) Vesicular stomatitis virus (VSV)-AV1 takes advantage of genetic defects present within cancerous cells and preferentially targets and kills them. Normal cells are spared the cytotoxic effects of viral lysis and are left unharmed. CLL cells are largely resistant to VSV oncolysis due to an elevated protein expression level of Bcl-2 and Mcl-1 as well as the inhibitory interactions Bcl-2 and Mcl-1 form with pro-apoptotic and pro-autophagic proteins. It is a common approach to use combination therapy to overcome limitations with single agent treatment. In the studies presented within, VSV-AV1 treatment was combined with small-molecule Bcl-2 inhibitors as a means to overcome resistance to oncolytic virtotherapy observed in CLL patients.In the first strategic approach, we combined low-dose amounts of the pan–Bcl-2 inhibitor, Obatoclax, with VSV-AV1 and examined the effect on the apoptotic signaling pathway. Obatoclax and VSV-AV1 synergistically enhanced cell death in primary CLL cells. The combination therapy induced intrinsic apoptotic signaling through the activation of caspases-3 and -9 cleavage. Inhibitory complexes between Bcl-2:Bax and Mcl-1:Bak were disrupted as well. Pro-death protein, Noxa, was upregulated following VSV-AV1 infection and as identified as a critical mediator of apoptotic cell death..In the second approach, we examined VSV-AV1 virotherapy in combination with Bcl-2 inhibitors (Obatolcax or ABT-737) to elucidate the role of the autophagic pathway on cell death in primary CLL cells. We also investigated the crosstalk between the autophagic and apoptotic pathways following combination treatment. Bcl-2 inhibitor/VSV-AV1 therapy led to increased LC3-II and reduced p62 proteins levels, which signify the activation of autophagy. Inhibition of autophagy, with 3-methyladenine, significantly increased apoptotic cell death induced by Bcl-2 inhibitor/VSV-AV1 treatment. The combination therapy also abrogated Bcl-2:Beclin interactions thus stimulating the induction of autophagy.Altogether, our therapeutic strategies indicate that Bcl-2 inhibitors improve VSV-AV1 oncolysis in treatment-resistant hematological malignancies, such as CLL, with characterized defects in apoptotic and autophagic responses. / La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est un cancer qui affecte les globules blancs et provient de l'accumulation des lymphocytes B CD5+. La résistance à la mort cellulaire est attribuée à la surexpression de plusieurs protéines de pro-survie tel que « B-cell lymphoma 2 » (Bcl-2) et « myeloid cell leukemia (Mcl-1) » qui appartiennent à la famille de protéines apoptotiques Bcl-2. La surexpression de Bcl-2 et Mcl-1 dérégule les voies de signalisations apoptotiques et autophagiques et contribue au développement de la tumeur. La virothérapie oncolytique a démontré son efficacité comme nouvelle thérapie anticancéreuse pour le traitement de plusieurs types de tumeur. Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV)-AV1 est un virus oncolytique qui prend avantage des anomalies génétiques présentes dans les cellules cancéreuses pour préférentiellement infecter et détruire ces dernières tandis que les cellules normales sont épargnées de la lyse virale. Cependant, les cellules affectées par LLC sont tout de même résistante à l'oncolyse par VSV à cause d'un niveau d'expression élevé des protéines Bcl-2 et Mcl-1, et de leur effet inhibiteur sur les protéines pro-apoptotiques et pro-autophagiques. Les thérapies combinées permettent de dépasser les limites imposées par les traitements utilisant un seul agent anticancéreux. Dans la présente étude, le traitement oncolytique VSV-AV1 a été combiné avec un autre agent anticancéreux, une molécule inhibitrice de Bcl-2, pour surpasser la résistance au traitement oncolytique par VSV-AV1. Dans une première stratégie, nous avons combiné une faible dose d'Obatoclax, un inhibiteur de Bcl-2, avec VSV-AV1 et examiné l'effet sur la voie de signalisation apoptotique. Obatoclax et VSV-AV1 ont augmenté de façon synergique la mort cellulaire des cellules primaires isolées de patients atteints de LLC. La thérapie combinée a induit la signalisation apoptotique intrinsèque en activant la caspase-3 et caspase-9 ainsi qu'en séparant les complexes inhibiteurs Bcl-2:Bax et Mcl-1:Bax. De plus, l'expression de la protéine pro-apoptotique Noxa a augmenté suite à l'infection avec VSV-AV1 et il a été démontré que cet événement est critique pour enclencher la mort cellulaire par apoptose. Dans une deuxième stratégie, nous avons examiné le rôle de la voie de signalisation de l'autophagie dans la mort cellulaire des cellules primaire LLC suite à la thérapie oncolytique avec VSV-AV1 en combinaison avec Obatoclax ou ABT-737, deux inhibiteurs de Bcl-2. Nous avons étudié l'interaction entre l'autophagie et l'apoptose suite au traitement combiné et démontré que le traitement a augmenté le niveau de LC3-II et a réduit le niveau de la protéine p62, ce qui indique une activation de l'autophagie. En contrepartie, l'inhibition de l'autophagie avec le 3-methyladénine a augmenté de façon significative la voie apoptotique. La thérapie combinée a également bloqué l'interaction entre Bcl-2 et Bectin et par conséquent stimulé l'induction de l'autophagie. Les stratégies thérapeutiques examinées dans cette étude indiquent que les inhibiteurs de Bcl-2 améliorent l'oncolyse virale dans les leucémies résistantes aux traitements simples et qui sont caractérisées par des anomalies dans la réponse apoptotique et autophagique, tel qu'observé chez les patients atteints de LLC.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119339 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Samuel, Sara |
| Contributors | John Hiscott (Supervisor1), Rongtuan Lin (Supervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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