Breast cancer is a heterogeneous disease, but is invariably associated with genome wide deregulation of transcription. The silencing of tumor suppressor genes (TSGs) in particular is thought to be an early, initiating event in many cancers. While re-expressing these genes is a clinically relevant goal, the development of therapeutics targeting the reactivation of TSGs has been hampered by a lack of understanding of the mechanisms responsible for TSG silencing. Recently, however, we have described a novel means through which several TSGs become silenced in cancer, which may highlight new therapeutic targets. This involves the epigenetic regulatory factor Ctcf which is critical for maintaining transcriptional activation and organizing chromatin at several TSG loci. In cells where these TSGs are silenced, the DNA binding of Ctcf to these TSGs is lost. This lack of DNA binding is associated with a loss of the post-translational modification by poly(ADP)ribosylation (known as PARylation). Aberrant dePARylation of Ctcf is associated with breast cancer progression, underscoring the importance of this Ctcf post-translational modification. We have novel data indicating that the dePARylating enzyme Parg is overexpressed in cancer. We hypothesize that inhibition of Ctcf PARylation by Parg disrupts normal epigenetic patterns at TSGs leading to subsequent gene silencing. We propose to examine the impact of Parg overexpression on the epigenetic programming and expression of Ctcf target genes, as well as the proliferation of breast epithelial cells. To determine the relevance of Parg in breast cancer, we have accumulated evidence from bioinformatics sources and through our own experimentation revealing an enrichment of Parg in a significant proportion of breast cancers. For instance, we have evidence from the Oncomine database and the UCSC Cancer Genome Browser that Parg is overexpressed at the mRNA level in 30-50% of breast cancers. Likewise, at the protein level, higher Parg expression is found in breast cancer cell lines compared to untransformed cell lines and is found to be enriched in more aggressive stages of a mouse tumor model. This is complemented with clinical breast tissue samples showing overexpression of Parg protein in breast cancer.In support of clinical data, we have generated Parg-overexpressing Mcf10a cells to assess the role of this protein in mediating cellular transformation. Interestingly, Parg overexpression induced cells to shift from an epithelial morphology to a mesenchymal one. This was met with a decrease in the rate of proliferation in vitro. The expression of the Parg transgene, however, was quickly lost and alludes to a significant role for Parg in cellular biology. Overexpression studies were complemented with drug and knockdown studies. This work illustrated that a shRNA knockdown of Parg was met with a significant decrease in cell growth. Similar results were obtained for cells treated with the Parg inhibitor, tannic acid. Use of this drug caused a decrease in the repressive histone mark H3K27me3 which we believe may restore the expression of silenced TSGs. Likewise, tannic acid induced DNA damage foci over the course of long treatments with the drug, suggesting that DNA damage, too, may contribute to the decrease in cellular proliferation observed. Ultimately, this work provides evidence for a therapeutic benefit of targeting Parg in breast cancer. / Le cancer du sein est une maladie hétérogène, invariablement associée à une perturbation de l'expression génique. Le silençage des gènes suppresseurs de tumeurs (GST) est l'un des phénomènes jouant un rôle lors de l'initiation du cancer. Si la réactivation de l'expression de ces gènes est une stratégie attractive sur le plan clinique, la mise au point de traitements efficaces a été entravée par la compréhension insuffisante des mécanismes responsables du silençage des GST. Récemment, de nouveaux mécanismes régulant le silençage des GST dans le contexte du cancer ont été décrit, ce qui pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Un des exemples concerne la protéine CTCF, un facteur essentiel au maintien de l'organisation de la chromatine et de l'activité transcriptionnelle à de nombreux loci du génome. Dans des cellules où des GST sont « silencés », la capacité de liaison de CTCF proche de ces gènes est perdue. La perte de cette liaison est due à l'abrogation d'une modification post-traductionnelle sur CTCF : la poly-(ADP)-ribosylation (aussi appelée PARylation). Selon notre hypothèse, l'inhibition de la PARylation de CTCF par l'enzyme PARG, responsable de la déPARylation, perturbe les patrons de modification épigénétiques normaux des GST, ce qui aboutit au silençage de ces gènes. Nous nous proposons d'analyser l'impact de la surexpression de PARG dans le cadre du cancer du sein sur la programmation des modifications épigénétiques et l'expression de gènes cibles de CTCF, ainsi que sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires.Dans un premier temps, nous avons recueilli des données de sources bio-informatiques et de nos propres expériences, et nous avons pu observer une surexpression de l'ARNm de PARG dans 30 à 50% des cas de cancer du sein (UCSC Cancer Genome Browser et Oncomine). De plus, les niveaux protéiques de PARG sont plus importants dans les lignées cellulaires de cancer du sein par rapport aux lignées cellulaires non transformées. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé la lignée MCF10A (immortalisée mais non transformé) pour générer une lignée cellulaire surexprimant PARG afin d'évaluer le rôle de cette protéine dans la transformation cellulaire. Nous avons pu observer que les cellules surexprimant PARG étaient passées d'une morphologie épithéliale à une morphologie mésenchymateuse, et que leurs vitesses de prolifération avaient diminué. L'expression du transgène PARG a toutefois été rapidement perdue, ce qui laisse entrevoir le rôle significatif de PARG en biologie cellulaire.Dans un troisième temps, nous avons voulu observer les effets de la perte de PARG sur des lignées de cancer du sein en utilisant soit une drogue (acide tannique : TA) soit la technique des shARNs. Par ces deux méthodes, nous avons montré que la déplétion de PARG (ou inactivation) ralentie significativement la prolifération des cellules cancéreuses. De plus, le traitement avec l'acide tannique conduit d'une part à la formation de nombreux foyers de dommages à l'ADN, et d'autre part à la diminution de la marque répressive H3K27me3, ce qui pourrait conduire à la réexpression de GST. Enfin, ce travail permet de mettre en avant le potentiel de PARG comme cible thérapeutique dans le traitement du cancer du sein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119605 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Lovato, Amanda |
| Contributors | Michael Witcher (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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