Liver transplantation continues to be the only remedy for end-stage liver disease. Moreover, the number of recipients far exceeds the number of donors and patients die on waiting lists. Unfortunately, not all grafts survive the process of transplantation and marginal livers are discarded, as they would not tolerate the stresses of ischemia-reperfusion and therefore would not survive the process of transplantation. If we are to resolve these problems, and decrease the chasm between the donor and recipient numbers, we need to characterize how a normal liver survives the process of transplantation. / We have developed a protocol that allows us to characterize the normal liver's response to transplantation. Indeed, a liver that endures the process of transplantation must be able to limit the amount of damage caused by the various stresses related to cold ischemia and warm oxygenated reperfusion. Unfortunately, the process of transplantation is not easily amenable to the reduction much less the elimination of these stresses. Therefore, a means of investigating what happens to the liver during the process of transplantation was needed that would take into account the global effect of these variables on the graft's survival. / The underlying hypothesis of my thesis is that the surviving liver invokes protective mechanisms to moderate the damage that could occur as a result of transplantation in part by regulating the level and type of expressed genes. Using microarray technology, we determined the identity of the mRNAs that revealed a degree of regulation, either up- or down-regulation during the reperfusion phase of transplantation. Furthermore, because ischemia precedes reperfusion, the process of reperfusion per se includes all of the stresses associated with ischemia, e.g. all reperfused livers were ischemia preconditioned. Thus, to conduct our analysis biopsy specimens were taken at three time-points during the peri-reperfusion phase of the operation. Our methodology not only permitted us to identify regulated genes, it also allowed us to control for recipient blood-borne contribution of messenger RNA. Because the last biopsy specimen was taken 1h post-reperfusion, our list was comprised of immediate early genes. / Of the other immediate-early genes that were on our list, we found an up-regulated gene that coded for map kinase phosphatase-1 (MKP-1). Immunohistochemistry preformed on frozen human liver sections revealed expression of MKP-1 in hepatocytes. MKP-1 is a phosphatase is best known for JNK-1, p38MAPK and ERK1/2/5 dephosphorylation. Using transplantation relevant stresses in vitro, and HepG2 as a cellular model for hepatocytes, we characterized mkp-1 mRNA regulation. Furthermore, using the same protocol and MKP-1 shRNA expressed in HepG2, we found that a lack of MKP-1 protein expression increased apoptosis. The second gene, als2, we investigated was slightly down-regulated and coded for a protein called alsin. The latter is a RhoGEF, a guanine nucleotide exchange factor that activates Rac1, Rab5 and Ran. We proceeded to characterize alsin mRNA regulation in vitro using ischemia-reperfusion relevant stresses, as we did for MKP-1. Finally, we are seeking to determine if or how the Rho proteins (Rac1, Rab5 or Ran) are implicated during the "reperfusion" phase of the operation. All in all, our results indicate a hepatic coping mechanism invoked for the purpose of reducing the damage caused by the trauma of ischemia and reperfusion. / La transplantation du foie demeure le seul remède pour les maladies hépatiques mortelles. Malheureusement le nombre de donneurs d'organe est inférieur au nombre de patients. Cette situation s'aggrave lorsque l'on considère qu'un certain nombre de foies transplantés ne survivent pas et que ce ne sont pas tous les foies qui s'avèrent utilisables pour la transplantation. En effet, ces foies de « qualité inférieure » ne survivraient pas au traumatismes de l'ischémie et de la réperfusion donc ils sont refusés. Actuellement il n'existe pas de solution pour pallier ce nombre de foies à transplanter. fr / Nous avons développé une approche permettant de caractériser les mécanismes par lesquels un foie normal survit au processus de la transplantation. Un tel foie doit être en mesure de diminuer ou du moins de contrôler les effets toxiques associés aux stress d'ischémie froide et de la réperfusion tiède oxygénée. Malheureusement, le processus de transplantation ne peut être manipulé facilement de façon à réduire ou à éliminer les variables qui lui sont associées. Compte tenu ces observations, une analyse détaillée de ce phénomène doit tenir compte de l'effet global de ces variables sur la survie de la greffe. / Une hypothèse fondamentale de mon travail de thèse présuppose qu'un foie qui survit au processus de la transplantation doit être en mesure de contrôler les effets toxiques des stress associés à ce processus. Cette régulation peut être accomplie en partie par des mécanismes de contrôle de l'expression des gènes. En utilisant des biopuces à ADN, nous avons déterminé l'identité des ARN messagers régulés positivement ou négativement au cours de la phase de réperfusion de la transplantation. Cette phase de la transplantation est ciblée pour notre étude, puisque que le processus d'ischémie précède la réperfusion, le processus de réperfusion englobe tous les stress associés à l'ischémie. Afin d'accomplir notre analyse, des biopsies hépatiques ont été prélevées à trois intervalles de temps différents. Notre protocole expérimental nous a permis non seulement d'établir une liste de gènes qui étaient régulés à la hausse ou à la baisse, une heure après le ré-établissement du flot sanguin, mais aussi nous a permis d'éliminer les ARN messagers provenant du sang du receveur. Étant donné que la dernière biopsie prélevée était à une heure après la réperfusion du foie par la veine porte hépatique, notre liste de gènes fut composé de gènes immédiats précoces. / Parmi les gènes identifiés, le messager codant pour la map kinase phosphatase-1 (MKP-1), était régulé à la hausse. En utilisant des coupes de foie humain, l'immunohistochimie a révélé l'expression hépatocytaire de la protéine MKP-1. Cette protéine déphosphoryle les map kinases JNK-1, p38MAPK et ERK1/2/5. En simulant les stress d'ischémie et de réperfusion sur des cellules d'origine hépatomique, HepG2, nous avons caractérisé la régulation de l'ARN messager de MKP-1. De plus, en utilisant le même protocole nous avons déterminé les conséquences d'une pénurie de la protéine MKP-1 pour les cellules HepG2. Pour ce, nous avons exprimé du « shRNA » dirigé contre l'ARN de MKP-1, dans ces cellules, afin de diminuer l'expression de MKP-1. Ceci a causé une augmentation d'apoptose. Le second gène à l'étude était celui d'als2 qui code pour la protéine alsine, dont l'ARN messager était légèrement diminué en quantité lors de son évaluation par biopuces. L'alsine est une « RhoGEF », une protéine échangeuse de nucléotides, qui active les RhoGTPases Rac1, Rab5 et Ran. Nous avons procédé à la caractérisation de ce gène, en utilisant les conditions expérimentales préétablies avec MKP-1. La dernière étape se résume à déceler si ou comment les protéines RhoGTPases soient Rac1, Rab5 ou Ran, sont impliquées dans la phase de réperfusion du foie. En conclusion, nos résultats indiquent que le foie transplanté utilise différents mécanismes pour contrecarrer les effets des stress d'ischémie et de réperfusion.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.86695 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Boutros, Tarek |
| Contributors | Eric Chevet (Supervisor2), Peter Metrakos (Supervisor1) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Anatomy and Cell Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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