Surface-Enhanced, Laser-Desorption & Ionization, Time-Of-Flight Mass Spectrometry (SELDI-TOF MS) permits the study of the protein/peptide content of complex biological fluids such as plasma. This high throughput proteomic platform has been used to identify biomarkers for a wide range of inflammatory, infectious and neoplastic conditions. The promising results obtained in these varied conditions raised the possibility that SELDI could be applied to dengue virus (DV) infection to develop urgently needed diagnostic and prognostic tests. Plasma from pediatric Thai patients with either primary (1°) dengue fever (DF) (n=12) or dengue hemorrhagic fever (DHF) (n=9) as well as patients with either secondary (2°) DF (n=24) or DHF (n=27) were available for the Discovery Study. Fifteen samples from Thai patients admitted to hospital with other febrile illnesses (OFI) were analyzed and used as controls. Validation was accomplished using sera samples from 30 confirmed 2° DF, 54 2° DHF and 30 OFI cases from Puerto Rico (PR). Potentially diagnostic (DV vs. OFI) and prognostic (DF vs. DHF) SELDI peaks were considered if they had an initial p-value ≤ 0.05 and a 0.30 ≥ ROC-value ≥ 0.70. Furthermore, only the peaks that showed an intensity ratio between the two groups being compared ≥ 2 and followed the same pattern (i.e. either up- or down-regulated) in PR and Thai samples were considered as candidate biomarkers. Following these criteria, 33 diagnostic and 4 prognostic peaks were selected. Using Biomarker Pattern Software (BPS), an algorithm was developed and tested using two independent data sets (i.e. PR as the learning set and Thai as the testing set). A specificity and sensitivity ≥ 89% for diagnostic purposes was achieved. No algorithm for prognostic purposes with a specificity and sensitivity ≥70% using a single or a combination of the 4 selected peaks was achieved. Guided by these results, the most promising candidate biomarkers were identified using SDS-PAGE gels and tandem MS. More than 30 proteins were identified, five of which were detected in samples from both countries. The glycoprotein vitronectin (Vn) was selected for further, in depth study. In Thai subjects, we found that Vn precursor could differentiate between 1°DF and more severe DV infection (e.g.: DHF and dengue shock syndrome). The Vn precursor was readily found by Western blot in serum/plasma from healthy children as well as patients with OFI or 1°DF but it was not detectable in patients with 1°DHF, 2° DF, or 2° DHF. Surprisingly, these results could not be confirmed in the Puerto Rican samples although Vn does seem to be a biomarker if we consider the concentration of Vn found in both set of samples. The genetic background of the individuals studied and/or of the viral strains may account for these differences. The total Vn plasma concentration was lower in 2°DHF (about 20% Vn of normal plasma content) than in 2°DF samples (70% Vn of normal plasma) or in OFI and healthy samples with a p-value < 0.01. PR samples followed the same trend (2°DF > 2°DHF) with a significance of p-value<0.001. Although clinical manifestations of a 1° and 2°DV infection is clinically indistinguishable, more than 100 candidate biomarkers were found in Thai specimen that differentiated between the 1° and 2° DV infection proteomes. This suggests that the plasma proteome of patients with a 1° infection is markedly different than that of a patient with a 2° infection and that perhaps the underlying disease mechanism might differ in subtle ways. This study demonstrates the potential for high-throughput proteomics to develop useful diagnostic and prognostic tests for DF/DHF. Additionally, such biomarker studies may give unique insight into the mechanisms underlying the different manifestations of DV infection. / La SELDI-TOF MS permet l'étude du contenu protéomique de fluides biologiques complexes tels du plasma. Cette plateforme protéomique a été utilisé pour identifier des biomarqueurs dans une vaste panoplie de conditions inflammatoires, infectieuses, et néoplastiques. Les résultats prometteurs obtenus dans des conditions variées soulèvent la possibilité que la SELDI pourrait être appliquée à la maladie de la dengue afin de développer des tests diagnostiques (DV vs. OFI) et/ou pronostiques (DF vs. DHF) urgemment nécessités. Le plasma de patients pédiatriques thaïlandais souffrant soit de la dengue (DF) primaire (1°) (n=12) ou de la dengue hémorragique (DHF) (n=9) ainsi que de patients avec de la DF secondaire (2°) (n=24) et de la DHF (n=27) étaient disponibles pour la partie découverte de l'étude. Quinze échantillons de patients thaïlandais admis à l'hôpital avec d'autres maladies fébriles (OFI) ont été analysés et utilisés comme contrôles. La validation a été accomplie en utilisant des échantillons de 30 cas confirmés 2°DF, 54 2°DHF et 30 cas OFI du Puerto Rico (PR). Des valeurs initiales p ≤ 0.05 et 0.30 ≥ ROC ≥0.70 furent utilisées afin de déterminer quels pics moléculaires représentent des marqueurs potentiels. De ces pics, ceux avec un ratio d'intensité entre les deux groupes étant comparés ≥ 2 et démontrant une même tendance (i.e. soit régulé à la hausse ou à la baisse) dans les deux ensembles de données (Thaï et Portoricain) furent considérés comme candidats biomarqueurs. Respectant ces critères, 33 pics diagnostiques et 4 pics pronostiques furent sélectionnés. Avec l'aide du Biomarker Pattern Software (BPS), un algorithme fut développé et testé utilisant deux ensembles de données indépendants (i.e. PR pour l'ensemble apprentissage et Thaï pour l'ensemble test). Une spécificité et sensitivité ≥ 89% servant à des fins diagnostiques furent obtenues. Malheureusement, aucun algorithme pronostique ne put être développé qui démontra une spécificité et une sensitivité ≥70%. Les biomarqueurs candidats les plus prometteurs furent identifiés utilisant des gels SDS-PAGE et le MS/MS. Plus de 30 protéines furent identifiés, cinq desquelles retrouvées dans les échantillons provenant des deux pays. La glycoprotéine vitronectine (Vn) fut sélectionnée pour des études plus approfondies. Dans les patients thaïlandais, nous avons démontré que le précurseur de la Vn permet de différencier entre 1°DF et les cas plus sévères de la DV. La présence du précurseur de la Vn fut démontrée par un western blot du sérum/plasma des contrôles et 1°DF, mais ne fut pas détecté dans les échantillons provenant des patients avec 1°DHF, 2°DF, ou 2°DHF. Ces résultats ne purent être confirmés par les échantillons portoricains même si la Vn semble être un biomarqueur – considérant sa faible concentration par rapport aux contrôles - dans les deux régions du monde. La Vn est présente à de basses concentrations dans le plasma des patients avec 2°DHF (∼20% de la concentration normale) en comparaison avec les patients 2°DF (∼70% de la concentration normale) ou OFI et en santé avec une valeur significative p < 0.01. Les échantillons portoricains démontrèrent la même tendance (2°DF > 2°DHF), avec une valeur significative de p < 0.001. Malgré le fait que les manifestations cliniques entre une infection 1° et 2° de DV soient indiscernables, plus de 100 biomarqueurs candidats furent détectés dans les spécimens thaïs pouvant différencier entre ces deux protéomes. Ceci suggère que le protéome plasmatique d'un patient souffrant d'une infection 1° diffère nettement de celui d'un patient avec une infection 2° et que le mécanisme sous-jacent de la maladie pourrait différer de manières subtiles. Cette étude atteste le potentiel des plateformes protéomiques à développer des tests diagnostique et pronostiques pour le DF/DHF. En outre, ces biomarqueurs pourraient fournir une meilleure compréhension des différentes manifestations de la maladie de la dengue.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.103648 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Gilbert, Alexa |
| Contributors | Brian Ward (Supervisor1), Momar Ndao (Supervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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