Tight regulation of the double-stranded RNA (dsRNA)-activated protein kinase (PKR) is critical for the maintenance of cellular homeostasis due to its potent inhibitory role on general translation. Previously, we have identified the adaptor protein Nck-1 as a novel cellular regulator of PKR activation through its interaction with PKR. In this study, we further confirmed that Nck-1 limits PKR activation under normal conditions. However, we demonstrate that the control of PKR activation by Nck-1 is reversible, since significant levels of dsRNA override Nck-1's negative control of PKR activation and induce dissociation of Nck-1 from PKR. Our data show that Nck-1 needs to be in full length to interact and modulate PKR. In addition, we observed that the interaction of Nck-1 with PKR is independent of any functional Src-homology domains of Nck-1, but our findings showing that Nck-1 interacts with both the N- and C-terminus of PKR challenge this concept. Nonetheless, we uncovered that upon significant levels of dsRNA, dissociation of Nck-1 from PKR is due to the activation of the catalytic activity of PKR rather than to competition by dsRNA binding or change of PKR conformation during its activation. Finally, we provided further evidence supporting the occurrence of Nck-1 phosphorylation by PKR in vivo. Hence, Nck-1 not only buffers PKR activation but appears to be a substrate of PKR. Therefore, we propose that PKR-mediated phosphorylation is part of the mechanism that promotes Nck-1 dissociation from activated PKR. Taken together, our data confirm Nck-1 as a novel cellular modulator of PKR that limits PKR activation under physiological conditions. / La protéine kinase PKR, activée par l'ARN double brins (ARNdb), est connue pour jouer un rôle inhibiteur de la traduction des protéines. La régulation de PKR est donc critique pour le maintien de l'homéostasie cellulaire. Nous avons précédemment identifié la protéine adaptatrice Nck 1 comme étant un potentiel régulateur de l'activation de PKR, suivant son interaction avec PKR. Dans la présente étude, nous avons été en mesure de confirmer que, dans des conditions physiologiques, Nck-1 peut limiter l'activation de PKR par l'ARNdb. Cependant, le contrôle qu'exerce Nck-1 sur PKR est réversible puisque, lorsque la quantité d'ARNdb dépasse une certaine concentration, PKR est activée et alors Nck-1 se dissocie de PKR, l'empêchant ainsi de limiter son activation. Nos données démontrent également que Nck-1 doit être dans sa forme native pour interagir et moduler l'activation de PKR. De plus, il semble que l'interaction entre Nck-1 et PKR ne nécessite pas que les différents domaines homologues de Src (SH2 et SH3) présents chez Nck-1 soient fonctionnels. De plus, nous avons observé que Nck-1 interagit à la fois avec les domaines N- et C-terminaux de PKR. Nous démontrons également que lorsque les niveaux d'ARNdb atteignent un niveau seuil, Nck-1 se dissocie de PKR non pas à cause d'une compétition avec l'ARNdb, ni à cause d'un changement de conformation de PKR ou son autophosphorylation, mais est plutôt dû à l'activation du domaine catalytique de PKR. De plus, il semble que Nck-1 puisse être phosphorylé par PKR in vivo. Nck-1 est donc non seulement un modulateur de l'activation de PKR mais peut également servir de substrat pour PKR. Ceci nous amène donc à proposer que la phosphorylation de Nck-1 par PKR activée soit responsable du mécanisme de dissociation entre Nck-1 et PKR. En conclusion, nos résultats confirment Nck-1 comme étant un nouveau modulateur cellulaire de PKR, en limitant son activation dans des conditions physiologiques.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.96908 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Abu-Thuraia, Afnan |
| Contributors | Louise Larose (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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