Small G proteins of the Ras superfamily were reported as major regulators of various cellular functions and are known to play a role in numerous human pathologies, such as cancer. They are currently classified according to their amino acid sequence into five subfamilies (Ras, Rho, Rab, Arf and Ran). In order to systematically study their functions and redundancy, we have selected C. elegans as an experimental model. This organism was chosen since it provides a reliable simple model for the study of small G proteins: In addition to providing experimental advantages over other higher eukaryotes, C. elegans expresses well conserved small G proteins, in limited number. We used this model to perform an integrative analysis of the biochemical activities of small G proteins and to study the role of these enzymes in the maintenance of the endoplasmic reticulum homeostasis. We have first constructed a library of vectors containing 53 C. elegans GTPase genes cloned in various expression vectors. This strategy appeared very efficient since the success rate of our cloning approach was above 89%. Using two high throughput technologies, we have then developed assays to measure enzymatic activities (GTP affinity, exchange and hydrolysis activities) of small G proteins. Integration and analysis of these enzymatic results revealed that the amino acid sequence clustering only partially represents the enzymatic characteristics of small G proteins. This suggests that a biochemical classification would be more representative of small G protein function similarities than their current amino acid sequence-based classification. To develop on this idea, we have generated and collected data related to RNAi phenotypes, cellular and tissue localizations and mRNA co-expression to integrate various functional properties and proposed a more complete clustering of the Rho subfamily of proteins. Another biochemical characteristic studied in this project was the role of small G prote / Les petites protéines G de la famille des Ras sont impliquées dans de nombreux processus biologiques et elles sont impliquées dans plusieurs pathologies humaines telles que les cancers. Elles sont présentement classifiées à partir de leur séquence en acides aminés en cinq sous familles nommées Ras, Rho, Rab, Arf et Ran. Dans le but d'étudier leurs propriétés biochimiques, leurs fonctions et leur niveau de redondance de manière systématique, nous avons choisi le nématode C. elegans comme modèle expérimental. En plus des avantages expérimentaux que confère cet organisme, les petites protéines G y sont grandement conservées et beaucoup moins abondantes que chez les mammifères. Par conséquent, nous avons utilisé cet organisme pour étudier diverses fonctions de ces protéines, proposé une nouvelle classification fonctionnelle de la superfamille des Ras et étudier le rôle des GTPases dans la régulation des voies du stress du réticulum endoplasmique. Pour réaliser ce projet, nous avons tout d'abord identifié les gènes codant pour des GTPases chez C. elegans et construit une bibliothèque de vecteurs d'expression pour 53 d'entre eux. Cette stratégie s'est avérée très efficace, avec un rendement de clonage de plus de 89%. Ensuite, nous avons développé de puissants essais enzymatiques pour mesurer leurs activités biochimiques (affinité et hydrolyse du GTP et activité d'échange) en utilisant deux technologies à haut débit. De plus, l'intégration et l'analyse de ces valeurs enzymatiques nous ont permis de démontrer que la classification usuelle des petites protéines G ne corrèle pas totalement avec l'activité enzymatique de ces dernières. Par conséquent, nous avons collecté des données relatives à la localisation tissulaire et cellulaire, aux phénotypes ARNi ainsi qu'à la co-expression des ARNm de ces gènes afin de proposer une classification fonctionnelle des petites protéines G de la sous famille des Rhos
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.21958 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Caruso, Marie-Elaine |
| Contributors | Eric Chevet (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Surgery) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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