Vitamin D is produced in the skin or obtained from limited dietary sources. Two sequential hydroxylation reactions in the liver and kidney produce the active form of the hormone, 1,25-(OH)2D3, which binds to and activates VDR to regulate gene expression (genomic effects) or to VDRmem or MARRS to trigger certain signalling pathways (non-genomic effects). 1,25-(OH)2D3 is best known for its effects on calcium and phosphate metabolism, but it also possesses chemopreventive properties for many types of cancers, particularly those of the digestive tract.The anti-proliferative effects of 1,25-(OH)2D3 on SCC25, a head and neck squamous cell carcinoma cell line derived from the floor of the mouth, have previously been demonstrated in this lab. Here, I extend these finding by investigating mechanisms of gene regulation and by discovering novel genes implicated in proliferation and apoptosis regulated by 1,25-(OH)2D3.CCND2, CCNG2, MMP3 and BNIP3 are FoxO target genes, whose expression is controlled by 1,25-(OH)2D3. FoxO transcription factors are bona fide tumour suppressors regulating expression of genes implicated in cell cycle arrest, apoptosis and oxidative stress resistance. I show here that the four FoxO target genes are suppressed (CCND2) or stimulated (CCNG2, BNIP3 and MMP3) by 1,25-(OH)2D3 at the transcription level through activation of FoxO3a. This activation is achieved through deacetylation and dephosphorylation of the transcription factor mediated by SIRT1 and PP1, respectively. Additionally, the crucial role FoxO3a plays in 1,25-(OH)2D3-mediated regulation of these genes is demonstrated by the fact that ablation of FoxO3a attenuates or completely blocks gene regulation. To extend the list of VD-regulated genes implicated in cancer, a microarray analysis was performed. Ingenuity pathway analysis software was used to determine pathways and networks regulated by 1,25-(OH)2D3. Notably, one of the canonical pathways is VDR/RXR activation. Another canonical pathway displays down-regulation of genes responsible for chromosomal replication. In addition, a network of interacting genes constructed by IPA also shows that VD reduces DNA replication and progression through the cell cycle. Several VD-regulated genes (OLR1, MACC1, BIRC3, POLE2, PCNA, CCNB1, CCNA2, APPL1 and BIRC5) were selected and validated by qPCR. Interestingly, all of these genes are down-regulated by 1,25-(OH)2D3 and are over-expressed in various cancer types relative to normal tissues, as assessed using Oncomine. These results support potential mechanisms of VD actions in cancer. / RÉSUMÉLa vitamine D est synthétisée dans l'organisme à partir du rayonnement UV au niveau de la peau, ou bien produite à partir de certains produits spécifiques issus de l'alimentation. Deux réactions d'hydroxylation séquentielles, qui ont respectivement lieu dans le foie et les reins permettent la synthèse de la forme active de l'hormone, 1,25-(OH)2D3. Cette hormone régule l'expression de nombreux gènes via sa fixation au VDR (Récepteur à la Vitamine D) (effets génomiques) et cible également certaines voies de signalisation via sa fixation au VDRmem ou MARRS (effets non génomiques). 1,25-(OH)2D3 est plus connue pour ses effets sur le métabolisme du calcium et du phosphate, mais cette hormone possède également des propriétés chimio-préventives dans de nombreux types de cancers, particulièrement ceux concernant le système digestif. L'effet antiprolifératif de 1,25-(OH)2D3 dans la lignée cellulaire SCC25, (établie à partir de cellules dérivées d'une cavité buccale d'un carcinome de cellules squameuses du cou et de la tête), avait déjà été étudié dans le laboratoire. Durant ce projet, j'ai étendu ces résultats en m'intéressant aux mécanismes de régulation génique et en mettant en évidence de nouveaux gènes impliqués dans la prolifération et/ou l'apoptose régulée par 1,25D-(OH)2D3.CCND2, CCNG2, MMP3 et BNIP3 sont des gènes cibles de la famille des protéines FoxO, dont l'expression est contrôlée par 1,25-(OH)2D3. Les facteurs de transcription FoxO sont des suppresseurs de tumeurs validés, qui régulent l'expression de gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose et la résistance au stress oxydatif. J'ai mis en évidence ici, que les gènes cibles de FoxO sont régulés par 1,25-(OH)2D3 au niveau transcriptionnel, via l'activation de FoxO3a. En effet, l'expression transcriptomique de CCND2 est inhibée, tandis que celles de CCNG2, BNIP3 et MMP3 sont stimulées. L'activation a lieu grâce à la déacétylation et la déphosphorylation des facteurs de transcription FoxO, assurées respectivement par SIRT1 et PP1. De plus, le rôle central que joue FoxO3a dans la régulation génique assurée par 1,25-(OH)2D3 est mise en évidence, par le fait que cette régulation est atténuée ou complètement abolie par l'extinction de FoxO3a par siRNA. Afin d'élargir la liste de gènes régulés par la vitamine D impliqués dans le cancer, nous avons réalisé une analyse par microarrays. Le logiciel d'analyse « Ingenuity » a été utilisé pour déterminer quels sont les voies de signalisation et les réseaux régulés par 1,25-(OH)2D3, notamment la voie canonique de l'activation du VDR/RXR. Une autre voie signalisation impliquée dans la réplication chromosomique est inhibée dans nos conditions. Par ailleurs, un réseau de régulation de gènes réalisés par IPA, a mis en évidence que la vitamine D réduit la réplication de l'ADN et la progression du cycle cellulaire. De nombreux gènes régulés par la vitamine D (OLR1, MACC1, BIRC3, POLE2, PCNA, CCNB1, CCNA2, APPL1 et BIRC5) ont été identifiés et validés par qPCR. De façon intéressante, le logiciel Oncomine montre que l'ensemble de ces gènes est inhibé par 1,25-(OH)2D3 et est surexprimé dans de nombreux types de cancers comparativement à des tissus sains. L'ensemble de ces résultats coincident avec nos observations montrant que 1,25-(OH)2D3 induit l'arrêt du cycle cellulaire et inhibe la prolifération cellulaire.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.107691 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Dimitrov, Vassil |
| Contributors | John H White (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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