During embryogenesis, a number of key events regulate the correct patterning of an organism, one of them being the correct positioning of internal organs. One of the factors important for this process is the homeodomain transcription factor Pitx2c,which is asymmetrically expressed in the left lateral plate mesoderm. Previous work has shown that the N-terminal domain of Pitx2c is important for left-right patterning, in that overexpression of the N-terminus randomizes the direction of heart tube looping. It is believed that the overexpressed N-terminus is antagonizing the activity of endogenous Pitx2c by competing for binding to one or more critical interaction partners. In order to better understand the role of the N-terminal domain, I have performed two different yeast two-hybrid library screens to identify proteins that interact with this domain. In the first, I used the chick Pitx2c N-terminal domain, cloned into the pGBKT7 vector in-frame with the DNA binding domain of the GAL4 transcription factor as bait, against a mouse adult cDNA library cloned in-frame with the GAL4 activation domain in the pGADT7 vector. In the second, I used a mouse Pitx2c N-terminal domain against an embryonic E11 mouse cDNA library. The resulting interacting candidates were analyzed and four were chosen based on the number of times they appeared in the screens and their function. The four chosen were Npc2, Ubc, Ube2n and Ube2e1. GST pull-down experiments were performed to confirm their interaction with the mouse and chick Pitx2c N-terminal domains, and proteins for the interacting candidates were generated using a coupled transcription translation system. Only Ube2n and Ube2e1 were confirmed as interacting candidates, suggesting that Pitx2 may be ubiquitinated and this may be a regulatory mechanism. Future experiments will provide more insight on their role in interacting to the N-terminal domain of Pitx2c. / Durant l'embryogenèse, un certain nombre d'événements clés réglementent la structuration correcte d'un organisme, l'un d'eux étant le positionnement correct des organes internes. Un des facteurs importants impliqué dans ce processus est le facteur de transcription homéodomaine Pitx2c, qui est asymétriquement exprimé dans le mésoderme de la plaque latérale gauche. Des études antérieures ont démontrées que le domaine N-terminal de Pitx2c est important pour la structuration gauche-droite, puisque la surexpression de l'extrémité N-terminale randomise la direction de la courbure du coeur. Nous croyons que la surexpression de la portion N-terminale de Pitx2c antagonise son activité endogène en faisant concurrence pour la liaison à un ou plusieurs partenaires d'interaction critique. Afin de mieux comprendre le rôle du domaine N-terminal de Pitx2c, j'ai effectué deux différentes sélections en utilisant la méthode de double hybride dans le but d'identifier les protéines qui interagissent avec ce domaine. Lors de la première sélection, j'ai utilisé le domaine N-terminal Pitx2c du poulet, cloné dans le vecteur pGBKT7 avec le domaine liant l'ADN du facteur de transcription GAL4 comme appât, contre une librairie adulte d'ADNc de souris avec le domaine d'activation GAL4 dans le vecteur pGADT7 comme proie. Dans la seconde, j'ai utilisé le domaine N-terminal Pitx2c de la souris contre une librairie d'ADNc d'embryon de souris E11. Les candidats qui interagissent ont été analysés et quatre ont été choisis en fonction du nombre de fois qu'ils apparaissent dans les sélections et selon leur function: Npc2, Ubc, Ube2n et Ube2e1. Des immunoprécipitations utilisant le glutathion-S-transférase comme étiquette ont été réalisées afin de confirmer l'interaction entre les partenaires potentiels et les domaines N-terminaux de Pitx2c de la souris et du poulet. Des protéines pour les candidats potentiels d'interactions avec Pitx2c ont été générées en utilisant un système de transcription-traduction. Ube2n et Ube2e1 sont les seuls candidats qui ont été confirmés comme protéines d'interaction, mettant en avant l'ubiquitination comme étant un mécanisme putatif par lequel Pitx2c agit dans la structuration gauche-droite durant le développement embryonnaire.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.106609 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Siontas, Dora |
| Contributors | Aimee Ryan (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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