Covalent histone modifications play an important role in the regulation of transcription in all eukaryotic organisms. Methylation of the histone H3 on lysine 4 (H3K4) is an ancient histone mark that is associated with active transcription and serves as a binding site for a number of transcriptional activators. Enzymes that catalyze this modification have been linked to a variety of human pathologies including cancer and mental retardation. The mechanisms that regulate formation of H3K4 methylation during transcription remain poorly understood. H3K4 methylation is intimately connected with ubiquitination of histone H2B (uH2B), another conserved modification found at actively transcribed genes. In all organisms studied, uH2B is a critical activator of H3K4 methylation, and in yeast uH2B is an absolute requirement for processive methylation at this site. The basis for this trans-histone "crosstalk" pathway remains controversial, with some studies suggesting a direct stimulation of methyltransferase activity by uH2B, and others suggesting indirect effects of uH2B on the assembly and stability of methyltransferase complexes.Using unique recombinant chromatin substrates containing semi-synthetic ubiquitinated H2B, I successfully reproduced the trans-histone crosstalk in vitro and showed a direct stimulation of the modified histone H2B on the activity of the native Set1C H3K4 methyltransferase complex purified from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. In my in vitro system, uH2B was an absolute requirement for methyltransferase activity on nucleosomal histone H3, and could also modulate activity on H3 outside the nucleosome, consistent with direct contact between uH2B and the Set1C. Finally, I showed that Set1C purified from strains of S.pombe deficient in H2B ubiquitination had apparently wild-type activity and subunit composition, suggesting that uH2B does not act by altering Set1C stability in this organism. Altogether, my data suggests that H2B ubiquitination can directly stimulate the catalytic activity of the Set1C and that this might represent a fundamental and evolutionary conserved mechanism underlying uH2B/H3K4 methylation crosstalk. / Les modifications covalentes des histones jouent un rôle très important dans la régulation de la transcription chez tous les eucaryotes. La méthylation de l'histone 3 sur la lysine 4 (H3K4) est une marque d'origine primitive associée avec une transcription active des gènes qui sert de plateforme d'attachement pour un nombre important d'activateurs de transcription. Les enzymes qui catalysent cette modification sont associées à une grande variété de pathologies humaines telles que le cancer et des formes de retard intellectuel. Les mécanismes qui régularisent la méthylation de H3K4 pendant la transcription ne sont pas bien établis et en général mal compris. La méthylation de H3K4 est intimement reliée à l'ubiquitination de l'histone H2B, une autre modification au niveau des histones très conservée et aussi impliquée dans l'activation de la transcription. Dans tous les organismes étudiés, H2B ubiquitiné (H2Bu) fut désigné comme étant un facteur crucial pour l'activation de la méthylation de H3K4 et constitue chez les levures, une nécessité absolue pour obtenir une réaction de méthylation efficace sur ce site. La mécanistique entourant la diaphonie entre ces histones est controversée; alors que certaines études laissent croire à une stimulation directe de l'activité de méthyltransferase par H2Bu, d'autres sous-entendent un effet indirect employé par H2Bu pour contrôler l'assemblage et la stabilité du complexe de méthyltransferase. En utilisant des substrats uniques de chromatine qui contenaient des histones H2Bu semi-synthétiques, j'ai réussi à reproduire la diaphonie entre H2Bu et H3K4 méthylé in vitro et démontré un effet direct exercé par H2Bu sur la stimulation de l'activité d'un complexe de méthyltransferase natif, Set1C qui fut purifié à partir de la levure de fission Schizosaccharomyces pombe. Dans ce système in vitro, H2Bu était nécessaire pour permettre la méthylation de H3 lorsque ce-dernier était intégré dans un nucléosome. De plus, la présence de H2Bu stimulait l'activité catalytique du complexe Set1C sur des histones H3 hors d'un contexte nucleosomal, ce qui s'accorde avec l'hypothèse d'un contact direct prenant place entre uH2B et Set1C. Finalement, j'ai observé que des complexes Set1C purifiés à partir de variétés de S. pombe déficientes en H2Bu démontraient une activité et une composition comparable à celle de complexes purifiées de variétés sauvages signifiant que l'effet de H2Bu sur Set1C in vivo n'est probablement pas dû à un changement au niveau de la stabilité du complexe dans cet organisme. En conclusion, ces résultats démontrent que l'ubiquitination de H2B peut stimuler l'activité catalytique de Set1C par des moyens directs qui pourraient représenter, d'un point de vue évolutif, un mécanisme fondamental et conservé qui participe à la diaphonie entre H2Bu et H3K4 méthylé.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.106627 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Racine, Ariane |
| Contributors | Jason Tanny (Supervisor1), Moshe Szyf (Supervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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