Posttranslational attachment of ubiquitin (Ub) or poly-Ub chains marks proteins for various cellular fates and functions, including proteasomal degradation, endocytosis, endosomal sorting, and DNA repair. In general, three enzymes catalyze the ubiquitination reaction: activating enzyme (E1), conjugating enzyme (E2), specificity-determining Ub-protein ligase (E3). This thesis examines three distinct aspects of the ubiquitination of proteins.The recognition of substrates by UBR1 and UBR2 proteins: UBR proteins are E3-ligases that recognize certain N-terminal residues (N-degrons) as signals for protein degradation. For this reason, they are called N-recognins. N-recognition follows a turnover rule known as the N-end rule. Using X-ray crystallography, we determined the structure of the substrate-recognition domain of the UBR1 and UBR2 proteins with a bound ligand. These structures showed that the domain adopts a novel fold stabilized through the binding of three zinc ions and forms a binding pocket for N-degrons. Additionally, biochemical affinity measurements established the molecular principles for the recognition of positively charged N-degrons. The elucidation of the ubr-box structure in complex with a type-1 N-degron pioneered the understanding of N-end rule substrate recognition.Substrate binding and ubiquitination by UBR5 protein: UBR5 is an E3 Ub ligase containing a catalytic HECT domain and a peptide-binding domain. The peptide-binding MLLE domain recruits different regulatory proteins through a 12-residue peptide motif, termed PAM2. Using pull-down and ubiquitination assays, we demonstrated that the HECT domain interacts with the adjacent MLLE domain in a PAM2 dependent manner. This interaction modulates binding and ubiquitination of TopBP1, a substrate of UBR5. These results provided a new view on how different domains in UBR5 proteins work together for efficient substrate recognition and ubiquitination. The recognition of Ub or poly-Ub chains by the UBA domain of Swa2 protein: Ub-associated (UBA) domains are ∼40 amino acid motifs occurring in proteins associated with ubiquitination. Most UBA domains bind to mono-Ub as well as poly-Ub. A structural model of the Swa2p UBA domain in complex with Ub showed that Ub recognition occurs predominantly through an atypical interaction through helix α1 of the UBA. Mutagenesis and surface plasmon resonance revealed a second low-affinity Ub-binding site and preference of Swa2p UBA for poly-Ub binding. These results revealed a potential role of Swa2p UBA domain in binding poly-ubiquitinated proteins in vivo, and the UBA domains as communication elements in the Ub system.This thesis provides a better understanding of the mechanisms that the Ub pathway employs to assure selectivity and processivity at three different levels: substrate recognition by the N-end rule, substrate binding and ubiquitination by an E3 ligase, and the recognition of Ub species by UBA domains. / Les modifications post-traductionnelles des protéines par une molécule d'ubiquitine (Ub) ou par des chaînes de poly-Ub déterminent leur destin pour diverses fonctions cellulaires notamment la dégradation à travers le protéosome, l'endocytose, le tri endosomique ainsi que la réparation de l'ADN. De façon générale, trois enzymes catalysent une réaction d'ubiquitination: une enzyme d'activation (Ub-activating enzyme E1), une enzyme de conjugaison (Ub-conjugating enzyme E2), et une enzyme qui détermine la spécificité pour le substrat (specificity-determining Ub-protein ligase E3). Cette thèse porte sur trois aspects distincts impliqués dans le processus d'ubiquitination des protéines:La reconnaissance de substrats par les protéines UBR1 et UBR2: les Ub-recognins (UBR) sont des ligases E3 qui reconnaissent des résidus N-terminaux (N-degrons) comme signaux pour la dégradation des protéines. Cette reconnaissance suit une règle de rotation du nombre d'entités ciblées nommée N-end rule (règle du N-terminus). A l'aide de données de cristallographie aux rayons X, nous avons déterminé la structure du domaine UBR-box impliqué dans la reconnaissance du substrat des protéines UBR1 et UBR2 en complexe avec un N-degron. Ces structures montrent que le domaine UBR-box adopte un nouveau repliement stabilisé par trois ions zinc et qu'il forme une poche pour accueillir les N-degrons. Aussi, des mesures biochimiques d'affinité ont permis d'établir des principes moléculaires pour la reconnaissance des N-degrons qui sont chargés positivement.La fixation du substrat et son ubiquitination par la protéine UBR5: UBR5 est une Ub ligase E3 contenant un domaine catalytique HECT et un domaine de liaison peptidique, MLLE. Le domaine MLLE recrute plusieurs protéines régulatrices grâce à leur motif PAM2 composé de douze résidus. En procédant à des expériences de pull-down et à des essais d'ubiquitination, nous avons démontré que le domaine HECT interagissait avec le domaine MLLE adjacent de manière dépendante du motif PAM2. Cette interaction conduit à des changements conformationnels qui modulent le repliement et l'ubiquitination de TopBP1, un substrat d'UBR5.La reconnaissance d'Ubiquitine et de chaînes poly-Ub par le domaine UBA de la protéine Swa2: les domaines UBA (Ub-associated) sont composés d'environ quarante acides aminés présents dans des protéines associées à l'ubiquitination. Les domaines UBA se lient à des mono-Ub in vitro, mais semblent avoir une affinité supérieure pour les chaînes de poly-Ub. Un modèle structurel du domaine UBA de la protéine Swa2p en complexe avec une Ub montre que la reconnaissance de l'Ub se produit principalement par une interaction atypique grâce à l'hélice α1 du domaine UBA. Des essais de résonance plasmonique de surface combinés à de la mutagenèse ont révélé une faible affinité secondaire pour le site de liaison à l'Ub et une préférence de l'UBA de Swa2p pour la liaison aux poly-Ub. Ces résultats ont révélé un rôle potentiel du domaine UBA de Swa2p pour lier les protéines poly-ubiquitinylées in vivo.À trois niveaux différents, la reconnaissance du substrat par le règle N-fin, fixation du substrat et l'ubiquitination par une ligase E3, et la reconnaissance des espèces de l'ubiquitine par domaines UBA, cette thèse a fournir une meilleure compréhension du mécanisme qui la voie Ub emploie pour assurer la sélectivité et la processivité de garder le bon environnement homéostatique dans la cellule.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.110562 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Matta Camacho, Edna |
| Contributors | Kalle Burgess Gehring (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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