Aberrant activation of Notch receptors has been implicated in breast cancer. We and other have shown that the expression of a mutant Notch transcript coding mostly for the intracellular domain of Notch1 (Notch1IC) causes transformation of cells in culture and development of tumors in transgenic mice. However, the mechanisms contributing to Notch1IC-induced tumor formation remain elusive and the long latency before the appearance of tumors in Tg mice seems to indicate that Notch requires the collaboration of secondary mutations to induce transformation and tumorigenesis. In the aim of studying direct downstream effects of Notch1IC expression, we generated a Tet-ON inducible expression system for Notch1IC in Hc11 mammary epithelial cells. In the inducible cell lines established, expression of the transgene is only activated upon addition of doxycycline (DOX) to the culture media. The inducible cells were capable of forming colonies in soft agar when subjected to continuous DOX induction and transplantation of the inducible cells in DOX-treated recipient mice caused tumor formation with metastasis to the lungs. We performed a genome-wide microarray-based expression analysis to compare gene expression following 24-hr Notch1IC induction to that of their uninduced counterparts. There were 26 genes identified as being upregulated 2-fold and more upon expression of Notch1IC, while 5 genes were found to be downregulated. Most of these genes identified represent novel candidate Notch1 targets. Of the candidate Notch1IC targets found to be upregulated, expression of the transcript for M-cadherin, also known as CDH15, was most significantly elevated with a change of over 19-fold. M-cadherin is a member of the cadherin family of type I single-pass transmembrane domain proteins that mediate calcium-dependent cell adhesion. M-cadherin, first identified in myogenic mouse cells, is found predominantly in developing skeletal muscles and is highly expressed during secondary myogenesis. In mature skeletal muscle, M-cadherin is mainly detectable in satellite cells. A role for M-cadherin in tumors of epithelial origin has not been previously documented, nor has it been associated with the Notch signaling pathway. We first confirmed that M-cadherin was significantly upregulated by semi-quantitative RT-PCR in the Notch1IC-inducible system. In a time-course experiment, M-cadherin upregulation was observed within 2 hours of Notch1IC induction. In vivo, Notch1IC expression in mammary tumors from Tg mice also correlated with strong expression of M-cadherin, whereas M-cadherin was undetectable in non-Tg mammary glands. We further determined that the transcriptional upregulation of M-cadherin occurs, at least in part, through the canonical CSL-dependent Notch1 pathway. Moreover, using shRNA-mediated depletion of M-cadherin in cell lines derived from mammary tumors from our MMTV/Notch1IC, we were able to investigate the function of M-cadherin in Notch1IC-induced oncogenesis. Through in vitro and in vivo assays, M-cadherin was shown to be required for the transformation of MMTV/Notch1IC cells as well as for their ability to form tumors in mice. In light of these findings, we also examined gene expression of M-cadherin in several human cancer cell lines, including different subtypes of breast cancers. M-cadherin expression was confirmed and appears to also be activated by Notch1IC in a number of breast cancer cell lines. A cursory survey of publicly available human cancer gene expression datasets further corroborated an implication for M-cadherin in human cancers, as well as a correlation between the levels of expression of M-cadherin and Notch1. A better understanding of the mechanisms of action of M-cadherin could shed light on targeted therapeutic approaches for the treatment of Notch1-overexpressing cancers and possibly other human carcinomas. / L'activation aberrante des récepteurs Notch a été impliqué dans le cancer du sein. Notre groupe ainsi que quelques autres ont démontré que l'expression d'un transcrit Notch1 muté, codant principalement pour le domaine intracellulaire de Notch1 (Notch1IC) provoque la transformation des cellules en culture et le développement de tumeurs chez les souris transgéniques. Cependant, les mécanismes contribuant à la tumorigénèse induite par Notch1IC demeurent méconnus et la longue période de latence avant l'apparition de tumeurs chez les souris Tg semble indiquer que Notch nécessite la collaboration des mutations secondaires pour engendrer la transformation cellulaire et la formation de tumeurs. Dans le but d'étudier les effets directs en aval de l'expression de Notch1IC, nous avons généré un système d'expression inductible Tet-ON pour Notch1IC dans les cellules épithéliales mammaires Hc11. Dans les lignées cellulaires inductibles établies, l'expression du transgène n'est activée que lors de l'addition de doxycycline (DOX) au milieu de culture. Les cellules inductibles sont capables de former des colonies en agar lorsqu'elles sont induites à la DOX en continu, et elles forment des tumeurs avec métastases aux poumons lorsque transplantées dans des souris traitées à la DOX. Nous avons effectué une analyse de l'expression du génome entier par micropuce dans le but de comparer l'expression des gènes à la suite de l'induction Notch1IC durant 24 heures, à celle de cellules homologues non-induites. 26 gènes ont été identifiés comme étant régulés à la hausse (2 fois et plus) suite à l'expression de Notch1IC, tandis que 5 gènes ont été identifiés comme étant régulés à la baisse. La plupart des gènes ainsi identifiés représentent de nouvelles cibles candidates de Notch1.Parmi ces cibles candidates, l'expression du transcrit pour M-cadhérine (CDH15) a été le plus significativement élevée (19 fois). M-cadhérine, une molécule d'adhésion cellulaire, a été identifiée dans les cellules myogéniques de souris; la protéine est principalement exprimée durant le développement de muscles squelettiques et au cours de la myogenèse secondaire. Dans le muscle squelettique mature, M-cadhérine est principalement détectable dans les cellules satellites. Fait intéressant, un rôle pour M-cadhérine dans les tumeurs d'origine épithéliale n'a pas été précédemment documenté, d'autant plus que M-cadhérine n'a pas été associée à la voie de signalisation Notch.Nous avons d'abord confirmé la surexpression de M-cadhérine par RT-PCR semi-quantitatif dans les cellules Notch1IC-inductibles. In vivo, l'expression de Notch1IC dans les tumeurs mammaires de souris Tg corrélait également avec une forte expression de M-cadhérine. Nous avons également déterminé que la régulation de la transcription de M-cadhérine se produit, au moins en partie, par la voie de signalisation canonique (CSL-dépendante) de Notch1. Par ailleurs, en utilisant des shRNA pour supprimer l'expression de M-cadhérine dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs mammaires provenant de nos souris MMTV/Notch1IC, nous avons pu étudier la fonction de M-cadhérine dans l'oncogénèse induite par Notch1IC. Par le biais d'essais in vitro et in vivo, nous avons démontré que M-cadhérine était requise pour la transformation des cellules MMTV/Notch1IC ainsi que pour leur capacité à former des tumeurs chez la souris. Par la suite, nous avons également confirmé l'expression de M-cadhérine dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein. Un bref survol de bases de données d'expression génique dans des cancers humain suggère que M-cadhérine serait impliquée dans plusieurs types de cancers, et qu'il y aurait une corrélation entre les niveaux d'expression de M-cadhérine et de Notch1 dans certains cancers du sein.Une meilleure compréhension des mécanismes d'action de M-cadhérine pourrait mener à de nouvelles approches thérapeutiques ciblées pour le traitement des cancers surexprimant Notch1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.110389 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Hobeika, Alice |
| Contributors | Paul Jolicoeur (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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