Schistosomiasis and fasciolosis are parasitic diseases that affect a great number of people, particularly in developing countries, and cause huge global morbidity. Diagnosis is essential for control, treatment and prognosis of the diseases and yet a simple, cheap, sensitive and specific assay is not readily available for either of them. In the current study, cathepsin B (SmCB) and cathepsin L1 (FhCL1) were investigated as potential diagnostic reagents to detect schistosomiasis and fasciolosis, respectively, in humans. The genes encoding SmCB and FhCL1 were expressed Pichia pastoris and the proteins isolated to homogeneity by affinity chromatography. The SmCB ELISA was optimized for antigen concentration, primary antibody dilution and secondary antibody dilution using a pool of sera obtained from patients that were coprologically-positive or negative for schistosomiasis. A clear distinctive was achieved between these two sera pools. However, when employed to screen a panel of patients from Senegal the test failed to provide satisfactory discrimination between schistosoma-infected and schistosoma-negative individuals. The FhCL1 ELISA was optimized using sera from Fasciola-infected individuals from Cuba, and samples from Cuban and Canadian non-infected patients. We determined the optimal dilution for the primary antibody and also assessed/compared the performance of anti-total IgG, IgG4, IgG1 and IgG2 secondary conjugated antibodies. Total IgG provided the best discrimination between Fasciola- infected and non-Fasciola infected individuals with a 99.99% sensitivity and specificity. Furthermore, by screening sera obtained from patients infected with various worm and protozoan diseases we showed that the FhCL1 ELISA does not cross-react with other diseases commonly found in similar geographical regions as fasciolosis. In conclusion, diagnosis of human schistosomiasis still remains uncertain and more studies need to be performed to improve our diagnostic test using SmCB. On the other hand, we have developed a simple, sensitive, specific and accurate test to detected human fasciolosis by using FhCL1, a major protease released by the parasite. The P. pastoris expression system allowed us to obtain up to 80 mg of FhCL1 enzyme per 4 L culture. Therefore, we not only have developed a standardized test that showed high specificity and sensitivity but we also have the methodology to obtain sufficent quantities of antigen needed future mass screening of human fasciolosis in affected regions. / La schistosomiase et la fasciolose sont deux maladies parasitaires qui touchent un grand nombre de personnes, en particulier dans les pays en développement, causant une morbidité élevée. Le diagnostic est essentiel pour le contrôle, le traitement et le pronostic de ces maladies et pourtant aucun essai simple, abordable, sensible et spécifique n'est disponible à ce jour pour l'une d'entre elles. Dans le cadre de la présente étude, cathepsine B (SmCB) et cathepsine L1 (FhCL1) ont fait l'objet d'une investigation sur leur potentiel à être utiliser pour diagnostiquer la schistosomiase et fasciolose, respectivement, chez les humains. Dans la présente étude, les gènes encodant SmCB et FhCL1 ont été exprimés dans Pichia pastoris et les protéines isolées par chromatographie d'affinité. Le test ELISA pour SmCB a été optimisé pour une concentration en antigène et pour une dilution d'anticorps primaire et secondaire en utilisant un pool de sérums provenant de patients qui étaient positifs ou négatifs pour la schistosomiase suivant des examens coprologique. Une distinction claire entre ces deux bassins de sérums a été observée. Toutefois, lorsque le test a été utilisé pour dépister des patients du Sénégal, il a échoué à fournir une discrimination satisfaisante entre les individus infectés et non-infectés par la schistosomiase.Le test ELISA pour FhCL1 a été optimisé à l'aide de sérums provenant de personnes cubaines infectées par la fasciolose et de patients non-infectés de Cuba et du Canada. Nous avons déterminé la dilution optimale pour l'anticorps primaire et également évalué et comparé la performance des anticorps secondaires conjugués contre les IgG totaux, IgG4, IgG1 et IgG2. Les IgG totaux ont fourni la meilleure discrimination entre les personnes infectées et non-infectées par la fasciolose avec une sensibilité et une spécificité de 99.99 %. En plus, en appliquant le test de dépistage sur des patients infectés par d'autres variétés de vers et de protozoaires, nous avons démontré que le test ELISA pour FhCL1 ne réagit pas de façon croisée avec d'autres maladies retrouvées couramment dans les régions géographiques où se trouve la fasciolose.En conclusion, le diagnostic de la schistosomiase humaine reste encore incertain et d'autres études doivent être effectuées pour améliorer notre test de dépistage utilisant SmCB. D'autre part, nous avons développé un test simple, sensible, spécifique et précis pour le dépistage de la fasciolose humaine en utilisant FhCL1, une protéase majeure relâchée par le parasite. Le système d'expression de P. pastoris nous a permis d'obtenir jusqu'à 80 mg de FhCL1 par 4 litres de culture. Dans la présente étude, nous avons non seulement mis au point un test standardisé démontrant une spécificité et une sensibilité élevées, mais également développé une procédure pour produire de grandes quantités d'antigènes nécessaires au dépistage à grande échelle de la fasciolose humaine dans les régions touchées.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.110691 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Gonzalez Santana, Bibiana |
| Contributors | John Dalton (Internal/Cosupervisor2), Momar Ndao (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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