Peroxisomes are organelles found in eukaryotic cells where several oxidative processes take place. Enzymes destined for the peroxisome generally contain either a C-terminal or a N-terminal peroxisomal targeting signal, named PTS1 and PTS2 respectively. These signals are cytosolically recognized by their correspondent receptors PEX5 and PEX7 prior to being recruited at the surface of the peroxisomal membrane where the complex docks onto PEX14. Then, enzymes are transported in a natively folded fashion inside the organelle where they are released. In trypanosomatids, other metabolic pathways, including glycolysis, are also segregated in the organelle, which has been renamed the glycosome to better reflect its purpose. To gain a better understanding about this transport and translocation machinery that exist in Leishmania donovani, we have first looked at the quaternary structure of the docking protein LdPEX14, and the implication of several domains on the protein using various biochemical and biophysical techniques. Using gel permeation chromatography, analytical ultracentrifugation and chemical cross-linking, we observed that LdPEX14 was forming large oligomeric structures of varying sized both in solution and within the parasite. By domain mapping studies, we identified three domains on LdPEX14, the LdPEX5 binding site, an hydrophobic region and a predicted leucine zipper, to all being implicated in the formation of such oligomer. Moreover, we investigated the structural changes that take place on LdPEX14 upon binding LdPEX5. Both isothermal titration calorimetry and fluorescence spectroscopy revealed that the hydrophobic region of LdPEX14 became more exposed to the solvent upon attachment to LdPEX5. Likewise, circular dichroism studies demonstrated that a portion of LdPEX14 was losing some secondary structure upon binding to LdPEX5, which was also linked to the formation of a more compact complex based on analytical ultracentrifugation experiments. We hypothesized that these structural features and conformational changes could be link to the formation of pore that will facilitate the translocation of proteins targeted to the glycosome. Such oligmeric structure was also confirmed by immunoelectron microscopy using parasite sections. LdPEX14 clusters adopted round, rosette-like shapes of about 30-40 nm in diameter and were found mainly at the surface of the glycosomal membrane. A lipidomic investigation of the glycosomal membrane from Leishmania donovani revealed the presence of very long chain polyunsaturated fatty acids, and of a relatively high proportion of the negatively charged phospholipids phosphatidyl glycerol and phosphatidyl inositol. These phospholipids appeared to be essential for a proper membrane attachment of LdPEX14. Domain mapping showed that the hydrophobic region of LdPEX14, comprised between the amino acids 149 and 179, was essential for proper binding to liposomes mimicking the glycosomal membrane phospholipid composition. Bioinformatics analysis revealed that this region also contains a important cluster of basic residues which we hypothesize could be involved in the initial membrane attachment. A further investigation using fluorescence spectroscopy showed that this region was sufficient for binding to liposomes mimicking the glycosomal and was penetrating the lipid bilayer. By performing a dye leakage assay from the liposomes, we observed that ldpex14 (120-200), a peptide comprising the hydrophobic region of LdPEX14, was capable of perforating the liposomes and cause a leakage of the encapsulated dye. Finally, using density flotation assays with liposomes, we demonstrated that not only LdPEX14 was recruting LdPEX5 at the surface of the bilayer, but that LdPEX5, upon attachment, was adopting a conformation similar to integral membrane proteins. This observation tends to suggest that LdPEX5 could also be implicated in the pore formation for the translocation of glycosomal enzymes. / Le peroxysome est un organite où plusieurs procédés oxydatifs prennent place. Les enzymes destinés au peroxysome contiennent un signal peptidique soit à leur terminal C ou N, nommés PTS1 ou PTS2 respectivement. Ce signal est reconnu dans le cytoplasme par son récepteur correspondant (PEX5-PTS1, PEX7-PTS2) où le complexe PTS1-PEX5/PEX7-PTS2 s'arrime à PEX14. Ensuite, les enzymes sont transportés sous leur forme native à l'intérieur de l'organite où ils sont relâchés de leur récepteur. Chez les trypanosomatides, plusieurs voies métaboliques, incluant la glycolyse, sont ségrégées dans l'organite (renommé le glycosome pour refléter la présence d'enzymes glycolytiques). Afin d'obtenir une meilleure compréhension à propos du transport et de la machinerie de translocation existant chez Leishmania donovani, nous avons d'abord déterminé la structure quaternaire, en utilisant diverses techniques biochimiques et biophysiques. En faisant usage de la chromatographie d'exclusion stérique, de l'ultracentrifugation analytique et de la réticulation chimique, nous avons observé que LdPEX14 forme de larges structures oligomériques de taille variable en solution et dans le parasite. En excluant différents domaines sur LdPEX14, nous avons identifiés trois domaines impliqués dans la formation de ces oligomères: (i) le site d'attachement à LdPEX5, (ii) une région hydrophobe et (iii) une glissière à leucine. De plus, nous avons recherché quels étaient les changements structuraux prenant place sur LdPEX14 lors de l'attachement à LdPEX5. En utilisant la calorimétrie isotherme à titration et la spectroscopie de fluorescence, nous avons découvert que la région hydrophobe de LdPEX14 devenait exposée au solvant lorsque LdPEX5 s'y attachait. De plus, des études de dichroïsme circulaire ont démontré qu'une portion de LdPEX14 perdait une partie de sa structure secondaire lors de l'attachement à LdPEX5, ce qui fut aussi relié à la formation d'un complexe LdPEX14-LdPEX5 plus compact, tel qu'illustré par ultracentrifugation analytique. Nous avons donc supposé que ces propriétés structurelles et ces changements de conformation seraient liés à la formation d'un pore qui faciliterait la translocation des protéines dirigées vers le glycosome. La structure oligomérique de LdPEX14 fut aussi confirmée par microscopie immuno-électronique en utilisant des sections de parasite. La protéine LdPEX14 s'assemblait en grappes formant des rosettes d'environ 30 nm de diamètre, principalement à la surface extérieure de la membrane du glycosome. Une étude lipidomique de la membrane du glycosome a révélé une proportion importante de phosphatidyl glycérol et de phosphatidyl inositol, phospholipides chargés négativement. Ces derniers sembleraient essentiels pour l'attachement de LdPEX14 à la membrane du glycosome. Nous avons ensuite démontré que la région hydrophobe de LdPEX14, comprise entre les acides aminés 149 et 179, était essentielle pour l'attachement à des liposomes imitant la membrane du glycosome. Une investigation plus poussée, utilisant la spectroscopie de fluorescence, a montré que cette région était suffisante pour l'attachement à des liposomes imitant la membrane du glycosome, et était de plus capable de pénétrer cette membrane. En effectuant un test d'écoulement de colorant fluorescent encapsulé dans les liposomes, nous avons observé que ldpex14(120-200), un peptide comprenant la région hydrophobe de LdPEX14, était capable de perforer les liposomes et causer un écoulement du colorant fluorescent. Finalement, en utilisant des tests de flottaison par densité différentielle avec des liposomes, nous avons démontré que non seulement LdPEX14 est capable de recruter LdPEX5 à la surface des liposomes, mais que LdPEX5 finissaient par adopter une conformation semblable à une protéine membranaire intégrale. Cette observation tend à suggérer que LdPEX5 pour elle aussi être impliquée dans la formation d'un pore pour la translocation d'enzymes destinés pour le glycosome.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114123 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Cyr, Normand |
| Contributors | Armando Jardim (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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