Vitamin D is a key modulator and regulator of mineral and bone homeostasis. The main active form of vitamin D in the body is the 1,25-(OH)2D metabolite that is formed in the kidney from 25-(OH)D by the enzyme CYP27B1. The enzyme CYP24A1 initiates the C24-oxidation pathway that leads to degradation of the hormonal form of vitamin D, but is also responsible for the synthesis of 24,25-(OH)2D. The putative biological activity of 24,25-(OH)2D remains unclear, but it has been found that following tibial fractures in chicks, the levels of CYP24A1 activity and serum 24,25-(OH)2D are both elevated. Our laboratory has engineered a mouse deficient for the Cyp24a1 gene to study the role of 24,25-(OH)2D, and has identified a putative membrane receptor (FAM57Bv2) to 24,25-(OH)2D. In this study we assessed the biomechanical properties (stiffness and force needed to break) of the repaired bones of mutant and wild-type mice at different intervals in the presence or absence of treatment with exogenous 24,25-(OH)2D. We also assessed the mRNA and protein expression of the putative receptor in different organ tissues of wild-type mice. Methods: wild-type and Cyp24a1-deficient mice were subjected to a modified open osteotomy with subsequent intramedullary nailing of the tibia, followed by subcutaneous treatment with vehicle (propylene glycol) or 6.7 µg/kg of 24,25-(OH)2D. Tibiae were collected on days 18 and 28 post operatively, and the biomechanical properties were tested using a three point bending testing machine. To assess the mRNA and protein expression of Fam5bv2 in different tissues, qRT-PCR, western blot analysis and immunohistofluorescence were performed. Results: at day 18, we observed significantly inferior biomechanical parameters in the male and female mutant mice injected with vehicle compared to their wild-type littermates. These differences were rescued by exogenous administration of 24,25-(OH)2D. No statistically significant differences were measured at day 28. qRT-PCR analysis showed high mRNA expression of Fam57bv2 in skin and cartilage, while western blot analysis showed FAM57B (all isoforms) to be expressed in all tissues studied. Immunohistofluorescence studies showed detection of FAM57B in brain paraffin sections, and kidney and tibial cryosections. Conclusion: The results of this study confirm the delay of fracture healing in Cyp24a1-deficient mice and support a role for 24,25-(OH)2D in optimizing fracture healing. Our expression monitoring results show that the putative receptor for 24,25-(OH)2D, FAM57Bv2, is broadly expressed with enrichment in chondrocytes, which may contribute to improved fracture healing. / La vitamine D est un modulateur clé de l'homéostasie des minéraux. La forme active de la vitamine D est la 1,25-(OH)2D synthétisée au niveau du rein par l'action de l'enzyme CYP27B1 sur le précurseur 25-(OH)D. L'enzyme CYP24A1 initie la voie d'oxydation C24 qui conduit à la dégradation de la forme hormonale de la vitamine D, mais est également responsable de la synthèse de 24,25-(OH)2D. L'activité biologique de la 24,25-(OH)2D demeure controversée, mais il a été constaté qu'à la suite de fractures du tibia chez les poussins, les niveaux d'activité de la CYP24A1 et les niveaux sériques de 24,25-(OH)2D sont stimulés. Notre laboratoire a mis au point une lignée de souris déficientes pour le gène Cyp24a1 afin d'étudier le rôle de la 24,25-(OH)2D, et a identifié une molécule qui pourrait agir comme récepteur membranaire pour la 24,25-(OH)2D (FAM57B2). Dans cette étude, nous avons évalué les propriétés biomécaniques (rigidité et la force maximale pour rompre) des os réparés chez des souris mutantes et de type sauvage, suite à un traitement en présence ou absence de 24,25-(OH)2D exogène. Nous avons également évalué l'expression de l'ARNm et de la protéine du récepteur putatif dans différents organes chez les souris sauvage. Méthodes: les souris de type sauvage ou déficiente pour le gène Cyp24a1 ont été soumise à une ostéotomie ouverte modifiée du tibia avec insertion d'un clou médullaire, suivie d'un traitement sous-cutané avec le véhicule (propylène glycol) ou avec 6,7 g/kg de 24,25-(OH)2D. Les tibias ont été prélevés aux jours 18 et 28 suivant la chirurgie, et les propriétés biomécaniques ont été testées en utilisant un test de flexion à trois points. Pour évaluer l'ARNm et l'expression de la protéine de Fam57bv2 dans différents tissus, une amplification par PCR quantitative, l'immunobuvardage et l'immunohistofluorescence ont été utilisés. Résultats: au jour 18, nous avons observé que les paramètres biomécaniques sont nettement inférieurs chez les souris mutantes mâles et femelles injectées avec le véhicule par rapport aux animaux de type sauvage. Ces différences disparaissent suite à l'administration de 24,25-(OH)2D exogène. Aucune différence statistiquement significative n'a été mesurée au jour 28. L'analyse qRT-PCR a montré une expression elevée de l'ARNm de Fam57bv2 dans la peau et le cartilage, tandis que l'analyse par immunobuvardage a montré que FAM57B (toutes les isoformes) est exprimée dans tous les tissus étudiés. L'immunohistofluorescence a permis de détecter FAM57B dans des coupes en paraffine de cerveau et dans des cryosections de rein et de tibia. Conclusion: Les résultats de cette étude confirment le retard de la guérison des fractures chez les souris déficientes en Cyp24a1 et soutiennent un rôle de la 24,25-(OH)2D à optimiser la guérison des fractures. Nos résultats concernant l'expression de FAM57B montrent que le récepteur potentiel de la 24,25-(OH)2D, FAM57Bv2, est exprimé à des niveaux élevés dans les chondrocytes, ce qui appuie une contribution mécanistique au cours de la guérison des fractures.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119501 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Hamade, Bachar |
| Contributors | Rene St-Arnaud (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Surgery) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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