Mammalian alkali cation/proton exchangers, more commonly known as sodium/proton exchangers (NHEs) are a family of transmembrane proteins that mediate an electroneutral exchange of Na+ (or K+) and protons across cellular membranes, thereby regulating intracellular pH and volume homeostasis. Eleven different isoforms have been identified, which differ in their tissue distribution, subcellular localization, and function. The organellar-type NHE6 isoform is widely distributed in tissues, but is enriched in brain, heart, and muscle. In order to elucidate the native distribution of NHE6 and to identify some of the mechanisms underlying its trafficking and function, a rabbit polyclonal antibody was generated. Utilizing this antibody in polarized human SH-SY5Y neuroblastoma cells, endogenous NHE6 was detected in transferrin receptor-containing vesicles in the soma and neurite processes. In mouse hippocampal organotypic slice cultures, NHE6 was detected within the soma, as well as dendritic shafts and spines of CA1 pyramidal cells. Ultrastructural analysis of mouse hippocampus and cortex revealed the presence of NHE6 positive signals predominantly in dendrites, occasionally adjacent to postsynaptic densities, and to a minor extent in some presynaptic terminals. N-glycosylation of proteins is involved in different aspects of protein function, such as folding, trafficking, stability and activity. To identify the glycosylation site(s) and their potential role in NHE6 function, mutagenesis analysis in combination with different biochemical assays and confocal microscopy were used. Our results revealed that asparagine 128 is the sole target for the N-glycosylation of the transporter. Furthermore, glycosylation was involved in promoting efficient export of the exchanger to the cell surface and for optimal transport activity within recycling endosomes.The NHEs have been shown to be regulated in part through the interaction of the cytosolic C-terminal domain with numerous interacting partners, depending on the isoform. In order to identify novel interacting proteins involved in the regulation of NHE6, a yeast two-hybrid screen of a human brain cDNA library was conducted using the C-tail of NHE6 as bait. Two of the clones identified encoded the receptor for activated protein kinase C 1 (RACK1), a scaffolding protein involved in numerous protein interactions and biological functions. Direct interaction of these two proteins was confirmed in vitro and in vivo. Depletion of RACK1 by siRNA resulted in increased total cellular expression and cell surface abundance of NHE6.Recently mutations in NHE6 have been linked to X-linked mental retardation, with a phenotype closely resembling that of Angelman syndrome. One of the mutations resulted in deletion of two residues (Glu255/Ser256) in the predicted transmembrane domain seven. To investigate the molecular mechanisms underlying the phenotype observed, we generated epitope-tagged variants of NHE6 bearing the deletion and showed that they display deficient processing and maturation, as well as markedly reduced stability in cells. Furthermore, the mutant protein is mislocalized in cells and targeted to an ill-defined acidic compartment. Preliminary results show that depletion of NHE6 in neurons resulted in decreased dendritic branching and disappearance of dendritic spines. We propose that the mutant protein is non-functional; thereby vesicular trafficking is impaired, resulting in deficient dendritic spine growth and maintenance. / Les échangeurs de Na+/H+ (NHEs) sont des protéines transmembranaires qui catalysent l'échange électroneutre de Na+ (ou K+) et de protons à travers les membranes cellulaires, régulant ainsi le pH intracellulaire et l'homéostasie du volume cellulaire. Jusqu'à présent, on été identifié onze isoformes, qui diffèrent dans leur distribution tissulaire, localisation subcellulaire, et leur fonction. L'isoforme NHE6 est largement distribué dans les tissus, mais il est plus exprimé dans le cerveau, le cœur et les muscles.Afin de déterminer la distribution native du NHE6 et d'identifier certains des mécanismes sous-jacents de son trafic et de sa fonction, on a crée un anticorps polyclonal. En utilisant celui-ci pour le marquage des cellules polarisées SH-SY5Y de neuroblastome, le NHE6 endogène a été détecté dans des vésicules contenant le récepteur de la transferrine, dans le corps cellulaire (soma) et au niveau des neurites. Dans des cultures cellulaires de l'hippocampe, le NHE6 a été détecté dans le soma et dans les dendrites ainsi que dans les épines des cellules pyramidales CA1 L'analyse ultrastructurale de l'hippocampe et du cortex de souris a révélé la présence des signaux positifs de NHE6 principalement dans les dendrites, parfois à côté de la région post-synaptique hyperdense, et dans une moindre mesure dans certaines terminaisons présynaptiques.La N-glycosylation des protéines est impliquée dans de différents aspects de la fonction des protéines, comme le pliage, le trafic, la stabilité et l'activité. Pour identifier les sites de glycosylation et leur rôle potentiel dans la fonction de NHE6, ont a utilisé la mutagenèse, en combinaison avec différents dosages biochimiques et la microscopie confocale. Nos résultats ont révélé que l'asparagine 128 est la seule cible de la N-glycosylation du transporteur. En outre, nous avons démontré que la glycosylation est nécessaire pour l'exportation efficace de l'échangeur à la surface cellulaire, ainsi que pour une l'activité optimal dans les endosomes de recyclage.Afin d'identifier des nouvelles protéines impliquées dans la régulation de NHE6, nous avons utilisé un système de double-hybride de levure. On a dentifiés deux clones qui codent le récepteur de la protéine kinase C (RACK1), une protéine d'échafaudage impliquée dans les interactions entre protéines. L'interaction directe de ces deux protéines a été confirmée in vitro et in vivo. L'utilisation de siRNA contre RACK1 conduit à une augmentation de l'expression cellulaire et de la densité sur la surface cellulaire du NHE6.Récemment, des mutations dans NHE6 ont été liées à un syndrome ressemblant à celui du syndrome d'Angelman. Une de ces mutations conduit a la suppression de deux résidus (Glu255/Ser256) dans le domaine sept transmembranaire. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents au phénotype observé, nous avons généré des variantes de NHE6 portant la suppression, qui on montré une maturation inadéquate, ainsi qu'une stabilité réduite dans les cellules. En outre, la protéine mutante est mal-localisée dans les cellules et se trouve dans un compartiment acide mal défini. Des résultats préliminaires montrent que l'utilisation de siRNA contre NHE6 entraine une baisse de ramification dendritique, ainsi que la disparition d'épines dendritiques dans des neurones. Nous proposons que la protéine mutante n'est pas fonctionnelle, et que le trafic vésiculaire intracellulaire est altéré, ce qui peut entraîner une déficience dans le développement de dendrites.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.96826 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Ilie, Alina |
| Contributors | John Orlowski (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Physiology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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